[发明专利]一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法

说明书

本发明提供一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，包括步骤：步骤(1)诱导无菌试管苗，选取淡水砂梨幼嫩新梢预处理后的带芽茎段为外植体，获得无菌试管苗；步骤(2)继代保存试管苗，将所述无菌试管苗切成高为1‑3cm、带1‑4片小叶的无菌试管苗茎段接入保存培养基并保存培养试管苗6‑7个月；步骤(3)恢复培养试管苗，将保存的试管苗的带节茎段接种于恢复培养基，室温和光照条件下进行恢复培养，本发明所提供的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法是一种消耗电能少，低保存成本的种质保存方法，本方法操作简单方便，工序少，本方法保存淡水砂梨种质资源的成活率高，恢复培养成活率可达90％以上。

技术领域

本发明涉及植物种质资源保存技术领域，具体涉及一种淡水砂梨种质离体 保存和恢复方法。

背景技术

现有的淡水砂梨种质资源的保存方法均采用通过枝梢嫁接并在果园栽培来 进行保存，该方法费时费力，受土壤和果园场地环境影响很大，且受各种自然 灾害和病虫害的影响，容易造成种质丢失，利用一般的组织培养技术保存淡水 砂梨种质资源，试管苗需要定期继代培养，即每隔1个月左右就需转接一次， 不断的重复转接工作造成大量人力物力的浪费，同时转接次数多，也增加了污 染机会，而采用低温或超低温保存技术，操作程序比较繁琐、设备成本大、耗 能高，为此，探索在常温条件下淡水砂梨种质能缓慢生长，可延长继代周期和降低保存成本的种质保存技术对当前种质资源离体保存具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，以解决现 有技术中占地多，易受环境影响和种质易丢失的问题。

本发明为解决上述问题所采用的技术方案为：

本发明提供一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，包括如下步骤：

步骤(1)诱导无菌试管苗：

选取淡水砂梨幼嫩新梢预处理后的带芽茎段为外植体，对所述外植体利用0.1％-0.3％的升汞溶液消毒10-16分钟，然后在超净工作台无菌环境下用无菌水 荡洗5-6次，再经无菌滤纸吸干水分后，用解剖刀将所述外植体切成具有1-3个 芽的长为0.5-2.0cm的带芽茎段，并接种到诱导培养基上，在每天光照13-15小 时、光照强度为1500-2100lx、温度为23-27℃条件下进行培养，所述带芽茎段 上的芽萌发和生长获得无菌试管苗；

步骤(2)继代保存试管苗：

将步骤(1)中获得的无菌试管苗，在超净工作台无菌环境下用手术剪刀剪 除下端叶片，并将所述无菌试管苗切成高为1-3cm、带1-4片小叶的无菌试管苗 的带节茎段，取所述无菌试管苗茎段形态学下端接入保存培养基，在每天光照 8-12小时、光照强度为1000-1500lx、温度为23-27℃的条件下保存培养6-7个 月；

步骤(3)恢复培养试管苗：

切取步骤(2)中得到的淡水砂梨试管苗的带节茎段，长为0.5-1.0cm，接 种于恢复培养基，在每天光照13-15小时、光照强度为1500-2100lx、温度为23-27 ℃条件下进行恢复培养，恢复培养30-50天的试管苗可接种转入保存培养基进行 继续保存或转入增殖培养基进行增殖或转入生根诱导培养基进行生根诱导。

进一步地，步骤(1)中所述的淡水砂梨幼嫩新梢预处理，处理的方法是： 将从野外采集的长为5-10cm的新萌发的淡水砂梨幼嫩新梢用水冲洗干净表面 污垢、灰尘、泥沙及其他杂物，再用饱和洗衣粉溶液浸泡5-10分钟，换净水漂 洗3-5次后置于流动净水冲洗5-12小时，直至冲洗干净后置于温度为4-10℃的 环境中保存备用。

进一步地，步骤(1)中所述的诱导培养基的组分包括MS(Murashige and Skoog)、0.5-1.0mg/L 6-BA/6-苄氨基腺嘌呤、0.10-0.20mg/LIBA/吲哚乙酸、25-30 g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述诱导培养基pH 5.6-5.8。