[发明专利]一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法

权利要求书

1.一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)诱导无菌试管苗：选取淡水砂梨幼嫩新梢预处理后的带芽茎段为外植体，对所述外植体利用0.1％-0.3％的升汞溶液消毒10-16分钟，然后在超净工作台无菌环境下用无菌水荡洗5-6次，再经无菌滤纸吸干水分后，用解剖刀将所述外植体切成具有1-3个芽的长为0.5-2.0cm的带芽茎段，并接种到诱导培养基上，在每天光照13-15小时、光照强度为1500-2100lx、温度为23-27℃条件下进行培养，所述带芽茎段上的芽萌发和生长获得无菌试管苗；

步骤(2)继代保存试管苗：将步骤(1)中获得的无菌试管苗，在超净工作台无菌环境下用手术剪刀剪除下端叶片，并将所述无菌试管苗切成高为1-3cm、带1-4片小叶的无菌试管苗的带节茎段，取所述无菌试管苗茎段形态学下端接入保存培养基，在每天光照8-12小时、光照强度为1000-1500lx、温度为23-27℃条件下保存淡水砂梨试管苗6-7个月；

步骤(3)恢复培养试管苗：切取步骤(2)中得到的淡水砂梨试管苗的带节茎段，长为0.5-1.0cm，接种于恢复培养基，在每天光照13-15小时、光照强度为1500-2100lx、温度为23-27℃的条件下进行恢复培养，恢复培养30-50天的恢复培养试管苗可接种转入保存培养基进行继续保存或转入增殖培养基进行增殖或转入生根诱导培养基进行生根诱导。

2.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(1)中所述的淡水砂梨幼嫩新梢预处理，处理的方法是：将从野外采集的长为5-10cm的新萌发的淡水砂梨幼嫩新梢用水冲洗干净表面污垢、灰尘、泥沙及其他杂物，再用饱和洗衣粉溶液浸泡5-10分钟，换净水漂洗3-5次后置于流动净水冲洗5-12小时，直至冲洗干净后置于温度为4-10℃的环境中保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(1)中所述的诱导培养基的组分包括MS、0.5-1.0mg/L 6-BA/6-苄氨基腺嘌呤、0.10-0.20mg/L IBA/吲哚乙酸、25-30g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述诱导培养基pH 5.6-5.8。

4.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(2)中所述的保存培养基组分包括1/2-1/3MS、1.0-1.5mg/L 6-BA、0.1-0.30mg/L NAA/萘乙酸、4-12mg/L PP333/多效唑、25-30g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述的保存培养基pH 5.6-5.8。

5.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(3)中所述的恢复培养基组分包括为MS、1.0-1.5mg/L 6-BA、0.05-0.10mg/L IBA、0.05-0.10mg/L GA3/赤霉素、25-30g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述的恢复培养基pH 5.6-5.8。

6.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(3)中所述的增殖培养基的组分包括MS、2.0-4.0mg/L 6-BA、0.1-0.30mg/L NAA、25-30g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述的增殖培养基pH 5.6-5.8。

7.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(3)中所述的生根诱导培养基组分包括1/2-1/4MS、0.4-0.6mg/L 6-BA、0.1-0.2mg/L NAA、25-30g/L蔗糖、4-7g/L琼脂中的一种或几种的组合，所述的生根诱导培养基pH 5.6-5.8。

8.根据权利要求1所述的一种淡水砂梨种质离体保存与恢复方法，其特征在于：步骤(3)中所述的增殖培养和生根诱导的培养条件为在每天光照13-15小时、光照强度为1500-2100lx、温度为23-27℃的条件下进行培养。