[发明专利]一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法

说明书

本发明涉及芝麻7种过敏原蛋白（Ses i 1~Ses i 7）的LC‑MS/MS‑MRM定性检测方法。该方法通过含7M尿素+2M硫脲的+4%CHAPS水溶液提取芝麻中的过敏原蛋白质，经胰蛋白酶4 h酶切，肽段脱盐后用纳升液相色谱高分辨串联质谱（NanoLC‑Q‑TOF）分析，利用Proteinpilot 5.0软件对高分辨质谱获得的数据进行搜库鉴定，选取响应高、无漏切、无可变修饰、长度25个氨基酸的肽段在NCBI上进行Blast比对，并在15种阴性样品进行特异性验证，挖掘得到共计12条芝麻各过敏原蛋白的特征肽段。同时采用SKYLINE软件对芝麻过敏原特征肽段构建MRM离子对，每条肽段6个，提高检测的灵敏度和准确度。能够高通量、简单、快速、准确且灵敏地检测芝麻各过敏原成分，对于保护消费者安全、促进食品进出口贸易、实施食品过敏原标识方法具有重大意义。

技术领域

本发明涉及基于质谱技术在过敏原检测领域的应用，具体的说，涉及一种LC-MS/MS-MRM靶向检测芝麻过敏原蛋白的方法。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum)又名脂麻、胡麻，在热带和亚热带广泛种植，据海关数据统计，2016年全球芝麻实际生产量约为450.90万吨。我国是芝麻生产、消费大国，2015年出口3.15万吨，进口80.59万吨，2016年产量63.00万吨。芝麻油和芝麻酱是深受百姓喜爱的调味品，芝麻籽因其受热能产生浓香，被用作调味料广泛添加于糕点、菜肴和饮品中。同时，芝麻也是常见的食物过敏原之一，芝麻过敏患者在接触芝麻及制品后会出现包括皮肤和粘膜反应、呼吸反应、胃肠道反应在内的全身性反应，甚至可能休克或死亡。

流行病学调查发现，美国约有50万消费者对芝麻及其制品过敏。各国儿童对芝麻及其制品过敏的比例为0.1-0.8％，其中美国和加拿大0.1％，澳大利亚0.8％，以色列0.2％。在以色列，芝麻是仅次于牛奶和鸡蛋的第三大常见食物过敏原。欧洲各国(意大利、法国、英国、丹麦、瑞典、瑞士等)及亚洲(日本)等国家都有芝麻过敏的相关报道近年来，随着芝麻过敏发病率的升高，芝麻过敏已引起全球更多国家重视。

由于芝麻及其制品在食品中使用广泛，芝麻过敏患者生活中接触芝麻过敏原的机会也大大增加。各国开展了对芝麻阈值的相关研究，发现芝麻过敏原的引发剂量(Eliciting dose，ED)ED05在芝麻蛋白的1.2到4.0mg之间，ED10在4.2和6.2mg之间。过敏原的正确标识是预防过敏患者误食相关食品的唯一有效途径。欧盟、加拿大、澳大利亚和新西兰等国要求含有芝麻成分的食品必须进行标识，2014年日本也建议生产商对含芝麻制品进行过敏原标识。过去十年，在澳大利亚因过敏原错误标识而召回的食品中，芝麻及其制品占3％(澳新食品标准局：http://www.foodstandards.gov.au)。食品在各生产环节(加工、储存、运输、销售)都有可能被芝麻过敏原污染(无意污染)。

截止2017年，经国际免疫联合委员会过敏原命名小组(IUIS)确认的芝麻主要过敏原包括2种2S白蛋白Ses i 1(9-14kDa)和Ses i 2(7kDa)，7S类豌豆球蛋白Sesi 3(45kDa)，2种油脂蛋白Ses i 4(17kDa)和Ses i 5(15kDa)，2种11S球蛋白Ses i 6(52.2kDa)和Ses i7(56.6kDa)。其中2S白蛋白和11S球蛋白是主要的过敏原蛋白。

对于芝麻过敏原，目前的的主要检测方法是PCR法和ELSIA法。PCR的方法具有较高的灵敏度，但是同一批的样品提取的核酸会经常出现假阴性或假阳性，并且检测的对象是DNA，而不是过敏原蛋白质。ELISA方法的特异性取决于抗原的制备，这限制了其应用范围，并且容易存在交叉反应或者产生假阴性结果；虽有快速试剂盒，但是各种商业化的ELISA试剂盒只能用于定性和半定量，并不能准确地检测芝麻过敏原，特别是痕量蛋白。并且食品加工工艺，如加热过程会破坏蛋白质结构使蛋白质变性，导致ELISA等免疫学方法检测结果出现假阴性。因此，建立一个既能直接检测致敏蛋白又能检测变性蛋白的检测方法用于食品中的芝麻过敏原的定量测定无疑是非常必要的。