[发明专利]一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种大豆HRM‑SNP分子标记点标记及其应用，进行大豆SNP标记的开发、浙鲜九号基因组DNA提取、高分辨率熔解曲线过程与分析、浙鲜九号基于HRM技术的SNP分型、浙鲜九号HRM分型验证、浙鲜九号SNP指纹图谱的构建。本发明具有高通量、分析时间短：一次可同时完成对96个或384个样品的分析，适合大规模开发和检测SNP位点；本发明操作简便，无需序列特异性探针以及后续测序，只需要设计PCR引物，进行PCR反应，接着直接进行HRM，便可完成对样品的基因型分析；本发明特异性好：PCR产物无需后续处理，完全闭管操作。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

到目前为止，进行SNP分型检测方法已有20多种。依据是否需要凝胶电泳以及自动化程度的高低，可以把SNP的检测方法大致分为两大类，一是基于凝胶电泳的SNP检测方法，像单链构象多态性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)、裂解扩增多态性序列分析(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)、等位基因特异PCR(AlleleSpecific PCR，AS-PCR)等；二是高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，像直接测序、DNA芯片、变性高效液相色谱分析技术(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、质谱检测、高分辨率熔解曲线(High-resolution Melting，HRM)等。

以上检测SNP方法各有优缺点，有的能精确检测出SNP位点，如DNA测序、DNA芯片技术，但其成本昂贵，不能普遍运用；有的操作复杂，耗时费力，如AS-PCR技术；有的高通量、成本低、结果准确，但对设备硬件要求较高，如HRM技术。理想的SNP检测法应具有如下特点：灵敏度以及准确度高；快速、简便、高通量；费用相对低廉。但到目前为止还没有完全符合以上特点的检测方法出现，因此可依据实际情况，选择较适宜的方法。

大豆是我国主要的油料和经济作物，已有五千多年的种植历史。因营养丰富、风味较好、经济效益高，且采收、加工、销售等形式多样化，而风靡中国、日本等亚洲国家。

虽然大豆起源于我国，但发展较晚，早期育种主要以从台湾省或者日本引进优异品种进行筛选或杂交选育为主，导致育种资源遗传基础较窄，不利于新品种的开发。而目前主要用于大豆各类研究的简单序列重复(SSR，Simple Sequence Repeat)标记，也存在数量相对较少、分析操作复杂、标记大小不易确定而无法跨研究使用等不利因素。

高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)技术是一种新型的SNP检测技术。近年来，随着该技术的不断发展完善，已被成功应用到基因分型、突变扫描、甲基化研究等多个方面，并且在马铃薯、苜蓿、柑橘等作物研究中得以成功地应用。因而，开发密度更高、分析更简便、基因型确定可以跨研究使用的SNP新型分子标记，具有非常重要的应用价值。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)目前主要用于大豆各类研究的简单序列重复(SSR，Simple Sequence Repeat)标记，也存在数量相对较少、分析操作复杂、标记大小不易确定而无法跨研究使用等不利因素。

(2)由于大豆基因组异常复杂，HRM技术本身对引物设计的要求比较高，在进行引物设的计过程中，经常会遇到SNP位点序列在基因组中不是唯一的、或者设计的引物有非特异扩增的情况。

解决上述技术问题的意义：