[发明专利]用于凋亡细胞识别和标记的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物化学和检验与检测领域，具体涉及黄色荧光蛋白标记的Annexin A5及其制备方法和在制备凋亡检测试剂中的应用。本发明以pET28a‑Annexin A5‑EGFP‑his重组质粒为模板，构建了重组质粒pET28a‑Annexin A5‑Citrine‑his、pET28a‑Annexin A5‑Venus‑his、pET28a‑Annexin A5‑Ypet‑his。大量表达Annexin A5‑Citrine、Annexin A5‑Venus和Annexin A5‑Ypet融合蛋白，通过Ni柱亲和层析纯化获得了这三种蛋白，纯度约为90％。流式细胞仪检测结果显示：Annexin A5‑Citrine、Annexin A5‑Venus和Annexin A5‑Ypet融合蛋白均可以识别和标记凋亡细胞，它们与凋亡细胞的亲和力分别是3113nmol/L，444.3nmol/L和391.6nmol/L。以上结果显示Annexin A5‑Citrine、Annexin A5‑Venus和Annexin A5‑Ypet融合蛋白均可以用于凋亡细胞的识别和标记。

技术领域

本发明涉及生物化学和检验与检测领域，具体涉及黄色荧光蛋白标记的 AnnexinA5及其制备方法和在制备凋亡检测试剂中的应用。

背景技术

细胞凋亡是细胞程序性死亡最常见的一种形式，它表现为细胞收缩、染色质固缩、细胞膜出泡、细胞凋亡蛋白酶caspase的激活以及细胞膜表面外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)呈现出“吞噬我”的信号。凋亡细胞的清除是通过吞噬细胞完成的，吞噬细胞可以识别死亡细胞的上述表型。检测细胞凋亡的方法大多是基于这些形态学的变化和生化指标。

目前，应用最为广泛的凋亡检测探针是Annexin A5。基于Annexin A5的凋亡检测方法是将Annexin A5联结上生物素、荧光素或放射性配体，使之成为一种可检测的标记物，在钙离子存在的情况下，将凋亡细胞与Annexin A5复合物进行混合，凋亡细胞就会迅速结合带有标记的Annexin A5。这种结合可以通过多种技术来测量，如流式细胞术、激光扫描细胞术、共聚焦激光扫描显微术等。正是因为Annexin A5能够与凋亡细胞外翻的PS结合，故它被作为凋亡检测的特异性探针在全世界被广泛应用。为了满足不同的需要，各种标记的Annexin A5 探针相继被开发，且相关产品也实现了商品化。

化学偶联方法标记的Annexin A5被广泛使用，如最常用的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的Annexin A5。该探针的制备过程包括蛋白的表达纯化、化学偶联荧光素以及后续游离荧光素的去除，这一过程涉及多步操作并需要精确控制，非常复杂繁琐；此外，氨基介导的化学修饰过程会导致Annexin A5蛋白与细胞膜PS的结合能力下降。另一方面，化学标记Annexin A5的最终产物通常是不同标记程度的混合物，非常不均一，从而限制了它们的使用。而融合了荧光蛋白的 Annexin A5则相对均一，且荧光强度高、光稳定性强。而同样是绿色荧光的 Annexin A5-EGFP荧光蛋白融合分子探针则不涉及化学偶联方法中的多步操作，只需要对融合蛋白进行原核表达和分离纯化，操作简便且成本低，极具应用价值。