[发明专利]一种抗肿瘤制剂及制备的方法

权利要求书

1.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，所述抗肿瘤制剂为搭载有anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的干细胞。

2.一种如权利要求1所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤制剂的制备方法包括：

通过文献以及数据库查找anti-PD-L1/PD-1人源化基因序列并合成(anti PD-1LC:http://www.addgene.org/105200/；anti PD-1 HC:http://www.addgene.org/105194/；anti-PD-L1需要自己构建)；

通过限制性内切酶和连接酶将上述片段连接进入商业化慢病毒或者腺病毒表达载体中；

通过培养293T细胞包装含有anti-PD-L1/PD-1人源化基因的目的病毒，检测滴度；

用上述病毒感染羊膜干细胞；

通过有限稀释法挑选表达anti-PD-L1/PD-1抗体的单克隆细胞株，通过筛选获取稳定表达高亲和力的anti-PD-L1/PD-1人源化抗体的单克隆细胞株，冻存以及大量扩增使之达到1×10⁶-1×10⁸数量级。

3.如权利要求2所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤制剂的制备方法进一步包括：或者使用纯化的PD-L1/PD-1蛋白免疫人源化小鼠，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇；在聚乙二醇作用下，促进淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；用HAT选择性培养基进行选择培养。

4.如权利要求2所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，购买商业化慢病毒或者腺病毒真核表达载体之后，通过限制性内切酶将质粒切开，与抗体核酸片段以及购买的跨膜区基因序列混匀，加入连接酶，使之两两组合链接；再通过琼脂糖凝胶分离所得核酸并对含有目的序列的区域进行切胶回收，保存。

5.如权利要求4所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，所述述质粒既含有目的序列，又具有包装慢病毒或者腺病毒的能力；将病毒包装辅助质粒与质粒共同混匀之后，使用转染试剂将之共转染进入293T细胞，包装成具有一次感染能力的假病毒，假病毒存在于细胞培养上清中；通过PCR试剂盒检测病毒滴度并-20℃保存病毒。

6.如权利要求4所述抗肿瘤制剂的制备方法，其特征在于，病毒搜集之后，体积上按照病毒：病毒感染增强试剂＝1000:1，使病毒感染进入羊膜干细胞中；通过测序检测目的序列在羊膜干细胞中的插入位置；同时通过抗抗体检测细胞总蛋白提取液中anti-PD-L1/PD-1的表达量是否增加，通过细胞免疫组化或者免疫荧光检测anti-PD-L1/PD-1的表达位置；通过抗原抗体检测该表达抗体与抗原的亲和力。

7.一种利用权利要求1所述抗肿瘤制剂制备的抗肿瘤药物。