[发明专利]一种屏障功能弱化模型的构建方法

权利要求书

1.一种屏障功能弱化模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、细胞的准备；

步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养；

步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养；

步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养，

其中，所述步骤一、细胞的准备的具体方法为：取原代表皮细胞，复苏扩增后，使用P4~P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×10⁵个/mL~5.0×10⁶个/mL，接种于培养瓶中，加FAD培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO₂条件下培养，

其中，所述FAD培养液，为F12与培养液DMEM按体积比为1:3混合配制，

其中，所述步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养的具体方法为：取对数生长期细胞，以培养液I制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵个/mL~5.0×10⁶个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加60~80mL培养液I，置于37℃、5%CO₂条件下培养0.5~2小时；后转入液下培养，培养时间为1~2天，每天换液，

其中，所述步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养的具体方法为：将步骤二中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液II，添加量为50~70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1~5天，每天换液，

其中，所述培养液II，为在培养液I中，增加氢化可的松5.0~10.0μg/mL，并添加维生素E为20.0~80.0μg/mL、谷胱甘肽10.0~80.0μg/mL、氯化钙0.03~0.2mM配制，

其中，步骤四中屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养的培养液为培养液III，其中，所述培养液III，为在培养液I中，降低氢化可的松浓度至0.1~2.0μg/mL，并添加蛋白激酶C抑制剂GF109203X为1~20ng/mL，

其中，所述培养液I，是以FAD为基础培养液，添加牛脑垂体浸提物BPE为10.0~100.0μg/mL、表皮生长因子1~10ng/mL、腺嘌呤10~50μg/mL、转铁蛋白5~12ng/mL、角质形成细胞生长因子1~10ng/mL、氢化可的松0.1~5.0μg/mL配制。

2.如权利要求1所述的屏障功能弱化模型的构建方法，其特征在于，所述步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养的具体方法为：将步骤三中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液III，添加量为50~70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1~5天，每天换液，培养结束。