[发明专利]具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡

说明书

本发明属于动物免疫检测领域，具体涉及具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡。该试纸卡包括样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜和PVC胶板；胶体金采用双抗原夹心和双检测线；猪瘟病毒蛋白金标垫上包被有保藏号为CCTCC NO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG；所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏号为CCTCC NO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区。

技术领域

本发明属于动物免疫应用技术领域。具体涉及一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡。

本发明的试纸卡可用于对猪瘟病毒抗体进行实时、快速的定量检测，对猪群健康水平、免疫后的抗体水平监测具有重要意义。

背景技术

猪瘟(classical Swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical Swine fevervirus，CSFV)引起的一种急性、热性、高接触性的猪传染病。猪瘟病毒主要通过消化道和呼吸道传染，其传播速度快，发病率和死亡率高，给全球养猪业带来巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为16种A类法定通报的动物传染病之一。多年来猪瘟也危害我国养猪业的发展，是目前发生最多、危害最大、流行最广的传染病之一，我国农业部将其法定为一类传染病。

猪瘟是一种急性烈性传染病，我国对猪瘟的成功控制主要依赖于疫苗免疫。因此，疫苗免疫效果的优劣对猪瘟的防控起到决定性作用。猪瘟抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，同时猪瘟抗体水平检测对于猪瘟免疫疫苗程序的制订也具有重要意义。

血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平，对疫苗免疫效果进行评价。常用的检测方法有猪瘟正向间接血凝实验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验等技术。其中间接血凝主观性强、检测效率低，不适合大批样品检测。酶联免疫吸附试验敏感性高、重复性好，但容易出现非特异性反应，且仅用于定性或者半定量检测。传统的猪瘟抗体定量测定方法是病毒中和试验，但此实验需要培养有感染能力的猪瘟病毒，没有资质的实验室难以开展此实验。且这些方法对操作人员、设备等有较高的要求，大多耗时较长(如血凝抑制试验需1～2小时；ELISA试验需2～3小时等)，不便于实时、快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay GICA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。

基于该技术，中国发明专利申请2008100004492公开一种快速检测猪瘟抗体的试纸条，该试纸条是通过肉眼判断检测线的有或无，来对猪瘟抗体进行阴性或阳性的定性检测，因而无法准确量化抗体含量；中国发明专利申请201610454481.2公开了一种快速定量检测猪瘟抗体的试纸盒及其制备方法，该试剂盒采用猪瘟E2和E0融合抗原分别作为标记抗原和捕获抗原，采用单检测线技术测定猪瘟病毒抗体含量，其样品浓度的定量检测线性范围具有一定的局限性。在常规的单检测线模式中，抗原抗体仅能够在有限区域反应，同时由于吸水垫和硝酸纤维素膜造成的样品液泳动迅速，导致抗原抗体反应时间短暂，使得检测线显色不明显，或对高含量检测物定量检测颜色差异度不显著。

发明内容

本发明的目的在于克服现有胶体金快速检测方法对定性检测或半定量以及定量检测方法中的灵敏度低和检测颜色差异度不显著的缺点，提供一种具有双抗原和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡与应用。