[发明专利]具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡

权利要求书

1. 一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜和PVC胶板；胶体金采用双抗原夹心和双检测线，其中：所述的猪瘟病毒蛋白金标垫上包被有保藏编号为CCTCC NO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG；所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏编号为CCTCC NO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，二者构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区；

样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线和羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜、PVC胶板顺序依次组装。

2.如权利要求1所述的一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，其中猪瘟病毒E2和E2a重组抗原的制备方法为：

用终浓度为0.1mM IPTG分别诱导重组大肠杆菌BL21 /pE2和重组大肠杆菌BL21 /pE2a，表达产物经纯化后分别获得猪瘟病毒E2重组抗原和猪瘟病毒E2a重组抗原。

3.如权利要求1所述的一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，其中重组的大肠杆菌BL21 /pE2的制备方法为：

在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取登陆号为GenBank:FJ598611.1的基因序列作为目标基因，所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述；

扩增E2蛋白基因，将其与pET-28a(+)载体连接，构建得到重组质粒pET-28a-E2；

用重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到保藏编号为CCTCC NO：M 2018060的重组大肠杆菌BL21 /pE2。

4.如权利要求1所述的一种具有双抗原夹心和双检测线的 猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，其中重组大肠杆菌BL21 /pE2a的制备方法为：

在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取登陆号为GenBank:FJ598611.1部分基因序列作为E2a目标基因，所述E2a目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述；

扩增E2a蛋白基因，将其与pET-28a(+)载体连接，构建得到重组质粒pET-28a-E2a；

用重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到保藏编号为CCTCC NO：M 2018059 的重组大肠杆菌BL21 /pE2a。

5.如权利要求1所述的带有双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡的制备方法，其特征在于按下列步骤制备：

A.猪瘟病毒E2蛋白金标垫的制备：

取胶体金溶液，用300~700µL 0.1mM K₂CO₃调节pH值；在搅拌状态下缓慢加入500~750µL1mg/mL 猪瘟病毒E2重组蛋白，搅拌30min；加入5% BSA溶液至终浓度为1%，继续搅拌30min；12000r/min, 4℃ 离心30min，弃上清，沉淀用重悬液重悬；1500r/min, 4℃ 离心20min，弃沉淀，即得到胶体金标记的猪瘟病毒E2蛋白；用喷金仪将制备好的金标猪瘟病毒E2蛋白均匀喷涂至金标垫，喷量为4.0~8.0µL/cm，置于37℃ 温箱干燥12h~18h，得到猪瘟病毒E2蛋白金标垫；

B.兔IgG金标垫的制备：

取胶体金溶液，用300~700µL 0.1mM K₂CO₃调节pH值；在搅拌状态下缓慢加入250~500µL1mg/mL 兔IgG抗体，搅拌30min；加入5% BSA溶液至终浓度为1%，继续搅拌30min；12000r/min, 4℃ 离心30min，弃上清，沉淀用重悬液重悬；1500r/min, 4℃ 离心20min，弃沉淀，即得到胶体金标记的兔IgG抗体；用喷金仪将制备好的金标兔IgG 蛋白均匀喷涂至金标垫，喷量为1.0~8.0µL/cm，置于37℃ 温箱干燥12h~18h，得到兔IgG金标垫；

C.包被猪瘟病毒E2a重组蛋白检测线的制备：用连续点膜仪分别将0.2~1.5mg/mL 不同浓度猪瘟病毒E2a重组蛋白均匀划线至硝酸纤维素膜上，划膜量为1µL/cm，37℃ 温箱干燥18h，备用；

D.包被羊抗兔IgG的质控线的制备：用连续点膜仪分别将0.2~0.8mg/mL 不同浓度羊抗兔IgG均匀划线至硝酸纤维素膜上，划膜量为1µL/cm，37℃ 温箱干燥18h，备用；

E．将样品垫用封闭液浸泡30min，于37℃下烘干，所述的封闭液的配方为0.5g Tris、2gNaCl、2g PVP K30、2g 酪蛋白、0.2g NaN₃、5ml TritonX-100，加入到900ml纯水溶解，待完全溶解后，混匀，用2mol/L NaOH调pH至9.0，再加纯水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤，4℃保存备用；

F. 控制试纸卡的成品检测线距金标垫端为5mm，控制质控线距吸水垫端为3mm。