[发明专利]T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽及其应用

说明书

本发明属基因工程技术领域，涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(P17)及其应用，本发明通过溶解度测定发现P17能提高三种不同单链抗体在大肠杆菌中的溶解度2‑8倍；该P17连接于原核表达的单链抗体氨基或羧基末端均能提高所述单链抗体的溶解度；通过缺失突变和点突变发现P17多肽的氨基和羧基末端序列以及位于羧基末端的α螺旋二级结构为其促溶作用所必需；偶联了P17多肽的单链抗体仍能高效结合靶抗原。所述P17多肽可用于制备提高大肠杆菌表达有结合活性的可溶性单链抗体产量的多肽或其他制品中。

技术领域

本发明书基因工程技术领域，涉及一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用

背景技术

研究表明，抗体(Antibody，Ab)是由浆细胞分泌且能特异性识别外来抗原(如细菌和病毒等)的免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，其由两条重链和两条轻链通过非共价键和二硫键结合组装成Y形蛋白；抗体重链和轻链可变区都包含能特异识别抗原表位的互补决定区(Complementary determining region，CDR)；而重链羧基末端的2或3个恒定区形成可结晶区域片段(Fragment crystallizable region，Fc)，后者介导诸多免疫调节功能(如激活免疫细胞和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)。研究显示，单克隆抗体(Monoclonalantibody，mAb)只识别某一特定抗原表位。因其均一性和特异性高而在诊断和治疗中广泛应用。目前mAb主要通过杂交瘤技术制备，mAb分子量约150kDa，组织和细胞渗透性较差；不同种属来源mAb(主要为Fc区)在人体使用时可诱生免疫反应；另外，目前mAb的生产成本还较高。

随着基因工程技术的发展，mAb已被改造成具有不同特征的多种衍生物，它们包括抗原结合片段(antigen binding fragment，Fab)、可变区抗体(variable fragment，Fv)、单链抗体(single chain variable fragment，scFv)和纳米抗体等；scFv是将mAb的轻、重链可变区经一柔性多肽连接而成的重组蛋白。一般地，scFv和初始mAb识别和结合相同的抗原表位，但scFv分子量更小(约30kDa)，因此组织渗透能力更强；而且scFv不会引发Fc段介导的免疫反应，这些优点使scFv在生物检测、细胞内免疫、影像诊断和靶向治疗等领域具有较高的应用价值。

有研究报道，scFv可在原核细胞(如大肠杆菌)，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，酵母和昆虫细胞等多种系统中表达，尽管分子量明显小于mAb，scFv重链和轻链可变区仍各包含能形成链内二硫键的半胱氨酸，而形成链内二硫键对于mAb和scFv正确折叠可能非常重要；普通大肠杆菌表达菌的细胞浆为还原性，这可能不利于链内二硫键形成而导致scFv形成无活性的包涵体，这些包涵体只能通过精致的复性方法获得活性，为了获得有活性的scFv，一种常用的方法是表达scFv与不同促溶蛋白标签的融合蛋白，这些具有促溶作用的标签蛋白包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白A(TrxA)、小泛素样修饰蛋白(SUMO)和氮源利用物质A(NusA)等，但是它们的促溶作用可能与scFv序列相关，并不总能提高scFv的溶解度；另一方法是在大肠杆菌氧化性的周浆间隙(Periplasmic space)中表达scFv，但产量较低。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一段能提高原核表达的单链抗体溶解度的多肽，具体涉及T7噬菌体尾部纤维蛋白多肽(命名为P17)及其应用。本发明尤其提供了一段来自T7噬菌体尾部纤维蛋白的33个氨基酸多肽P17可以提高不同scFv在大肠杆菌SHuffle表达株中的溶解度。