[发明专利]一种耐热性及比活力提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因

说明书

本发明涉及生物技术及酶工程领域，具体公开了一种耐热性及比活力均有提高的β‑甘露聚糖酶突变体Man5AS11R及其编码基因。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β‑甘露聚糖酶Man5A进行K16C和D296C的双突变，可得到突变体Man5AS，该突变体的耐热性较Man5A提高了5^oC，即Man5AS在80^oC高温下保持3min可残留80%以上酶活，而Man5A在只能在75^oC下保持3min维持80%酶活；在此基础上，针对Man5AS氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，继续进行R21V，I80D和I218E三个点的同时突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的突变体Man5AS11R，其耐热性较Man5AS保持不变的前提下，比活力较Man5A和Man5AS分别提高了22.5%和31.4%。显示了更好的开发应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术及酶工程领域，涉及一种耐热性及比活力提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因。

背景技术

目前，β-甘露聚糖酶是我国己经批准使用的12种饲料级酶制剂中的一种，并作为一种高效的饲料添加剂广泛应用于饲料工业中。从上个世纪90年代以来，欧美国家90%的家禽饲料中添加酶制剂，60%的猪用口粮中添加酶制剂。我国起步较晚，但其一直是饲料生产和应用研究的重点，甘露聚糖酶作为一种重要的饲料用酶，近年来受到了越来越多的重视。将甘露聚糖酶添加到鸡(家禽)饲料中，可有效的提高肉鸡的生长，提高蛋鸡产蛋率，提高饲料利用率，并且减少鸡粪便的排泄，减轻了环境压力。甘露聚糖酶应用在猪口常饲料中，可增强猪的抗病能力，减少抗生素等的应用，有利于生产高品质的猪肉及系列肉制品。然而，目前市场上的大多甘露聚糖酶在耐热性及酶活力等方面并不理想，成为甘露聚糖酶在饲料行业应用的瓶颈，亟待解决。另外，国内外市场上β-甘露聚糖酶因为酶活低、产量小，产品的相对价格很高，也大大降低了该酶的应用范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐热性和比活力均有提高的耐热酸性β-甘露聚糖酶突变体Man5AS11R，在饲料领域具有更为良好的应用潜力。

具体而言，本发明针对前期开发的耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5A进行必要的酶学特性改良，Man5A最适反应pH为3，且当pH在2.5-7.0范围内具有较好的稳定性，在动物胃液(pH 2.5)和肠道(pH 5.5)中均能保持较好的酶活性。最适作用温度为60^oC，在75^oC高温下3min可保持80%的酶活。然而，做为饲料添加剂应用其耐热性和酶活力还有待进一步提高。

为了提高Man5A耐热性，本发明对该酶的空间结构进行建模分析，通过引入一对分子内二硫键的方式提高该酶的耐热性，将该酶进行K16C和D296C双点突变，得到的突变体Man5AS在80^oC高温下3min可保持80%的酶活，较其野生型耐高温程度提高了5^oC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在Man5AS突变体基础上，本发明为了进一步提高酶活力，针对Man5AS进行空间结构的计算分析，定位催化活性中心附近4个关键氨基酸位点进行定点饱和突变，为达到高通量筛选突变体的目的，设计荧光底物，应用液滴微流控和高通量自动筛选等先进技术及设备，短时间内筛选得到了若干比活力提高的突变体，其中Man5AS11R比活力最高较Man5A提高了22.5%，测序发现其突变位点为R21V、I80D和I218E的三点突变，并进行定点突变验证，发现对R21V、I80D和I218E其中任意一个点或任意两个点突变均不能达到提高该酶比活力的目的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

另一方面，本发明还分别提供了编码序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的核酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5。