[发明专利]蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用

权利要求书

1.抗蛋白质MUC13的IgG作为血清标志物在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用，当血清中抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值2.9则判定为肝内胆管癌。

2.检测血清中抗MUC13的IgG的试剂在制备用于肝内胆管癌诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂为人源蛋白质MUC13，当血清中抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值2.9则判定为肝内胆管癌。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人源蛋白质MUC13是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒中包括酶标板、人源蛋白质MUC13、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述的人源蛋白质MUC13包被于所述酶标板上。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的包被缓冲液中含有1.59g/L Na₂CO₃以及2.93g/L NaHCO₃；

所述的标准血清包括标准血清A和标准血清B，所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酶标试剂中含偶联HRP的抗人IgG的二抗，浓度为0.1-1μg/mL。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30v/v％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB 350mg、DMSO 20mL和柠檬酸·H₂O 5.1g。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的封闭液中含有5g/L BSA、8g/L NaCl、0.2g/L KH₂PO₄、2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g/L KCl。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样品稀释液中含有8g/L NaCl、0.2g/LKH₂PO₄、2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g/L KCl。

10.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述洗涤液中含有8g/L NaCl、0.2g/LKH₂PO₄、2.9g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g/L KCl和0.5mL/L Tween-20；所述终止液为2mol/LH₂SO₄溶液。

11.如权利要求4所述的应用，其特征在于，使用所述的试剂盒用于肝内胆管癌诊断时，按照以下方法进行：

(1)包被：将纯化的人源MUC13蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；

(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2h时；洗涤液洗板3次，甩干；

(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品用样品缓冲液按照1:100稀释至100μL，加入到各自抗原测定孔板中，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜；

(4)孵育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤；

(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-Human IgG抗体100μL，37℃反应60分钟，甩净孔中液体，同上洗板5次拍干；

(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；

(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应；

(8)结果判定：

a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度

单位值(U/mL)＝(A450样品-A450标准血清A)/(A450标准血清B-A450标准血清A)

其中，A450表示450nm处吸光度；

b.血清中抗MUC13值的判定

当抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值2.9则判定为肝内胆管癌。