[发明专利]PLA2抑制剂编码基因的克隆方法

说明书

本申请涉及一种蟾蜍磷脂酶A2抑制剂PLI及其编码基因与克隆方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。所述蟾蜍磷脂酶A2抑制剂PLI的基因序列为SEQ ID No.1，翻译的氨基酸序列为SEQ ID No.2；和/或，基因序列为SEQ ID No.3，翻译的氨基酸序列为SEQ ID No.4；和/或，基因序列为SEQ ID No.5，翻译的氨基酸序列为SEQ ID No.6。将本申请应用于抑制剂的制备，具有无副作用、获取方便等优点。

技术领域

本申请涉及一种PLA2抑制剂编码基因的克隆方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。

背景技术

磷脂酶A2(PLA2)是一组数量众多的酯酶，几乎存在于所有真核细胞，在维持机体稳态中起着重要的作用。在磷脂的分解消化、脱酰基/酰化途径及平衡细胞磷脂池的过程中同样扮演重要角色。已发现30多种PLA2的亚型和相关的酶，根据结构、催化机制、作用位点和进化关系等将PLA2分为六个家族：胞浆型PLA2(cPLA2)、钙不依赖型PLA2(iPLA2)、分泌型PLA2(sPLA2)、溶酶体型PLA2(LyPLA2)、血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)和脂肪特异性PLA2(AdPLA2)。PLA2优先切割甘油磷脂的sn-2位酰基键，释放脂肪酸和溶血磷脂(LPLs，见式(1))。

脂肪酸主要是花生四烯酸(AA)，AA通过脂氧合酶(LOXs)和环氧合酶(COX-1和COX-2)的激活分别产生促炎介质白细胞三烯(LTs)和前列腺素(PGs)，LTs和PGs称为类花生四烯酸，在炎症和多种癌症的介导中发挥重要作用。另外AA和LPL可作为类花生四烯酸生物合成级联反应的前体。多项研究证实PLA2参与如关节炎、肠胃炎、哮喘、动脉粥样硬化和癌症等多种疾病的病理过程中，并且表明阻断PLA2酶解甘油磷脂产生花生四烯酸和溶血磷脂的反应对预防和治疗炎症相关疾病和癌症具有良好效果。

鉴于阻断PLA2活性对预防和治疗炎症相关疾病和癌症具有良好效果，因此开发和创新抗炎药成为国内外研究者对炎症治疗的研究热点。最早的抗炎药物是甾体类抗炎药(SAID)，其对抗炎症的效果显著，但是副作用较大。近期研究表明，sPLA2-IIA与细胞膜表面黏附分子整合素avb3的结合诱导肿瘤细胞迁移，而由苯环-噻唑-吡唑-AWD*I组成的拟肽分子却可以拮抗这种蛋白间的相互作用而抑制肿瘤细胞迁移，因此PLA2抑制剂的研制进入学者们的视野。国内外曾采用花生四烯酸AA作为PLA2的阻断剂，采用脂氧合酶和环氧合酶环氧化物阻断剂、血小板活化因子(PAF)和白细胞三烯(LT)受体拮抗剂抵抗炎症，但这些药物无法解决PLA2激活后对膜结构以及膜上受体功能的影响，尤其AA和溶血磷脂对绝大多数炎症反应细胞、脏器实质细胞膜的稳定性和融合均产生不利影响。目前，PLA2抑制剂(PLI)的研制是抗炎症治疗的重要方向，开发和研制一些抑制剂势在必行。

研究较早的PLI属于sPLA2抑制剂，主要为天然提取物。例如manoalide，属于上个世纪后叶出现的sPLA2抗炎症药物，通过从海洋生物的海绵中提取，并且已证实具有抗炎效果。该抑制剂的作用机理是两个经修饰的醛基与sPLA2的赖氨酸残基以共价键不可逆的方式结合，从而抑制酶的活性。之后从海绵中提取的抑制剂大都与manoalide相似，具有相近的作用机制与功能，它们通过与sPLA2的赖氨酸残基共价键结合来产生抑制效应。粉防己碱(tetrandrine)是从植物粉防己根部提取的生物碱，具有广泛的抗炎抗过敏效果，可降低PLA2、环氧化酶、PGE2的产生。另外，蛇毒的溶血磷脂酶可以导致神经中毒、出血、肌肉中毒、溶血、以及抗凝等多种毒理学活性，而毒蛇中的PLA2却无法使其自身产生上述的反应，原因在于毒蛇在长期进化过程中，蛇体产生这种毒素的同时也产生了对抗毒素因子，而这种因子在今天看来就是PLI。有趣的是这种抗毒因子不局限于毒蛇，Phisalix等早在1922年就发现一些动物如负鼠、欧洲刺猬和猫鼬中存在抗蛇毒蛋白，后来研究发现这些蛋白质属于抗蛇毒金属蛋白因子或者是抗蛇毒PLA2因子。其实有研究者发现这些PLI对许多毒素都有抗性，包括肌肉组织损伤、神经中毒、炎症，而且这些抗毒蛋白可以从无毒蛇类、哺乳类、以及最近发现的从药性植物中提取得到。