[发明专利]一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用

说明书

本发明公开了一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用。本发明通过克隆苯丙氨酸变位酶基因，构建高效表达的大肠重组菌，大量表达重组酶，采用硫酸铵进一步提纯重组酶，获得工业纯的苯丙氨酸变位酶，将其包埋在多巴胺自组装微囊中，制备成具有较高机械强度的固定化酶催化剂，应用于催化α‑苯丙氨酸合成高纯度的β‑苯丙氨酸。可广泛应用于β‑苯丙氨酸的生产制造领域。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其是涉及一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用。

背景技术

β-苯丙氨酸是β-内酯和内酰胺的前体，广泛应用于制药工。β-苯丙氨酸的生产主要是化学合成，由于化学合成路线复杂，反应步骤多，副产物多，导致生产成本高昂。酶学方法由于其专一性高，副产物少，反应条件温和，产率高等优点，是一种绿色生产工艺。苯丙氨酸变位酶(PAM)能催化α-苯丙氨酸(α-phe)的α位氨基异构化至β位，生成β-苯丙氨酸(β-phe)。本发明首先对苯丙氨酸变位酶进行固定化，制备稳定性高，机械强度高的催化剂，用于催化合成β-苯丙氨酸。

传统的固定化酶方法有两种，第一种是采用海藻酸钠、明胶等包裹酶，但是采用海藻酸钠、明胶作为固定化的材料，其酶的活性保存较好，但其机械强度低，不能长时间在反应器中运行，特别是在有搅拌的情况下，酶的重复利用次数较低。第二种是将酶通过共价连接的方式固定在机械强度高的材料上，如二氧化硅、二氧化钛等材料上，但是这种材料需要经过改性嫁接氨基、羟基等活性基团，然后通过戊二醛与酶进行共价交联，这种方法影响酶的结构，对酶的活性伤害较大，酶的活性降低较明显。因而，制备出具有一定机械强度，又不用戊二醛的进行共价交联的包埋方法制备固定化酶具有更好的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法，解决现有苯丙氨酸变位酶的固化方法不能同时保证机械强度和酶活性的问题。

本发明的另一个目的是提供β-苯丙氨酸的合成方法，解决现有化学法合成β-苯丙氨酸，副产物多，转化率低，光学度低的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种固化的苯丙氨酸变位酶，包括苯丙氨酸变位酶，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶包覆在精蛋白内，所述精蛋白的表面设置有硅酸钠层，所述硅酸钠层的外围包覆有多巴胺。

一种苯丙氨酸变位酶的固化方法，包括以下步骤：

1)将苯丙氨酸变位酶与碳酸钙(CaCO₃)溶于聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液中搅拌反应组装成CaCO₃(PSS)PAM微粒；

2)将CaCO₃(PSS)PAM微粒置于Tris-Hcl缓冲液中并加入精蛋白进行震荡处理得精蛋白-CaCO₃(PSS)PAM微粒；

3)将精蛋白-CaCO₃(PSS)PAM微粒加入硅酸钠溶液和Tris-Hcl缓冲液中反应30min得精蛋白-氧化硅-CaCO₃(PSS)PAM微球；

4)将精蛋白-氧化硅-CaCO₃(PSS)PAM微球和多巴胺一起加入Tris-Hcl缓冲液中反应12小时后得多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO₃(PSS)PAM微球；

5)将多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO₃(PSS)PAM微球和乙二胺四乙酸加入Tris-Hcl缓冲液中震荡处理得多巴胺-精蛋白-氧化硅-PSS-PAM的固定化酶微球，实现苯丙氨酸变位酶的固化。

进一步的，所述苯丙氨酸变位酶是将苯丙氨酸变位酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。