[发明专利]一种检测全基因组的单链DNA损伤的方法

说明书

本发明公开了一种检测全基因组范围的单链DNA损伤的综合性方法。其包括1)使用交联剂进行交联以捕获内源性的单链断裂；2)把染色质碎片化；3)经过核酸酶灭活后，细胞核进一步进行蛋白酶K处理以及交联逆转，分离获得基因组DNA；4)对纯化后的核酸片段进行加尾等步骤。本发明的检测精度至核酸水平。

技术领域

本发明涉及一种检测全基因组的单链DNA损伤(Single Strand Breaks，SSBs)的方法。

背景技术

DNA损伤被认为是癌症与衰老相关疾病的主要原因，与人类健康息息相关。DNA损伤有多种类型，其中单链断裂是最为普遍的一种。这些损伤表现为氧自由基位点的DNA损伤，该损伤在切除DNA修复通路以及相关中间产物如拓扑异构酶等过程中起调节作用。SSBs可通过复制叉停滞或者崩塌进一步恶化成更为严重的双链断裂(double strand breaks，DSBs)。SSBs本身就是细胞中的一个主要问题，它们可以抑制RNA

聚合酶的合成，甚至在一些情况下可以导致细胞凋亡。目前已有详细的SSBs修复通路，贯穿由发现到开始修复的每个步骤，更是体现DNA损伤的重要性。这些细胞通路的缺陷可导致细胞对基因毒性应急反应、胚胎致死以及一系列神经退行性疾病更敏感。

对SSB修复机制的详细步骤的需求与日俱增，然而与之形成鲜明对比的，是定位核苷酸的层面上的、全局的、精确无偏的内源性SSBs方法的严重缺失。相比之下，一系列综合性用于定位DSBs的方法已经较为成熟，例如BLESS[9],BLISS[10]等等其他。据了解，目前只有一个方法可以找到对应内源性SSBs，主要依靠SSB的3’-OH标记，引导DNA聚合酶I进行切口平移反应，用生物素化的核苷酸标记下游DNA。已标记的DNA经过纯化后，直接进行二代测序。然而，这个方法的主要缺点在于反应的产物是一段DNA区域，很有可能从原SSB位置中延伸出去几千个碱基，从而无法精确的从核酸层面上鉴定损伤位置。另外一方面，胡教授等人研发了一种有趣的在全基因组水平定位切除修复过程中的初级短的切除所导致的DNA断裂的方法，从核酸层面上精确的找到SSB。但是这个方法无法提供由其他机制产生的SSB的信息，因此无法综合反映SSBs。

参考文献：

1 Hoeijmakers,J.H.(2009)DNA damage,aging,and cancer.N Engl J Med 361,1475‐1485

2 Jackson,S.P.and Bartek,J.(2009)The DNA‐damage response in humanbiology and disease.Nature 461,1071‐1078

3 Caldecott,K.W.(2008)Single‐strand break repair and geneticdisease.Nat Rev Genet 9,619‐631

4 Kuzminov,A.(2001)Single‐strand interruptions in replicatingchromosomes cause double‐strand breaks.Proc Natl Acad Sci U S A 98,8241‐8246

5 Kathe,S.D.,et al.(2004)Single‐stranded breaks in DNA but notoxidative DNA base damages block transcriptional elongation by RNA polymeraseII in HeLa cell nuclear extracts.The Journal of biological chemistry 279,18511‐18520