[发明专利]基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法

权利要求书

1.一种gp5.5蛋白质在分离纯化大肠杆菌总tRNA中的应用，其特征在于，所述gp5.5蛋白质来自T7噬菌体基因5.5编码的小蛋白质，所述gp5.5蛋白质的氨基酸序列为序列表SEQID NO.4所示的第17-115位。

2.根据权利要求1所述的一种gp5.5蛋白质在分离纯化大肠杆菌总tRNA中的应用，其特征在于，所述gp5.5蛋白质氨基端加有蛋白标签，所述蛋白标签与gp5.5蛋白质之间由0～10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。

3.根据权利要求2所述的一种gp5.5蛋白质在分离纯化大肠杆菌总tRNA中的应用，其特征在于，所述蛋白标签为FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签、MBP标签中的一种。

4.根据权利要求2所述的一种gp5.5蛋白质在分离纯化大肠杆菌总tRNA中的应用，其特征在于，所述gp5.5蛋白质为T7噬菌体基因组中核酸代谢区域基因表达的蛋白质，所述蛋白标签为组氨酸标签，所述组氨酸标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述组氨酸标签与所述gp5.5蛋白质之间的连接肽段由10个氨基酸组成，所述连接肽段的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，携带序列表SEQ ID NO.2所示组氨酸标签及序列表SEQ ID NO.3所示连接肽段的gp5.5蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

5.基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1在大肠杆菌中过表达权利要求1中所述的gp5.5蛋白质并通过镍柱纯化获得gp5.5蛋白质的洗脱液，所述纯化获得的gp5.5蛋白质结合有tRNA；

S2.纯化gp5.5蛋白质结合的tRNA。

6.根据权利要求5所述的基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法，其特征在于，所述步骤S1的具体流程为：

a、细菌裂解：将菌体重悬于裂解液中，冷冻凝固后取出融化，置于冰上裂解1小时，接着再反复冻融两次；离心30分钟后将上清液过滤去除杂质；

b、镍柱纯化：在gp5.5蛋白质氨基端加上蛋白标签，使所述步骤a中得到的去除杂质的上清液通过镍柱，利用镍柱亲和层析在无RNA酶的环境下对表达的gp5.5蛋白质进行纯化，加入咪唑浓度由低到高的洗脱液洗脱镍柱，收集含gp5.5蛋白质的洗脱液；所述蛋白标签为组氨酸标签、FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签、MBP标签中的一种。

7.根据权利要求5所述的基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法，其特征在于，所述步骤S2的具体流程为：酚氯仿法纯化与gp5.5蛋白质结合的tRNA：按照体积比为3:1的比例将苯酚试剂溶液加入步骤S1收集含gp5.5蛋白质的洗脱液中，激烈震荡15-20秒，加入占苯酚溶液1/5体积的氯仿，再次剧烈震荡15-20秒，静置，离心，吸取上层水相溶液并加入1/10体积的3M NaAc，混匀后加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置，离心；倒掉上清后加入80％体积的预冷无水乙醇，离心，倒掉上清，晾干后保存或加入适量体积的DEPC水溶解后保存。

8.根据权利要求5所述的基于gp5.5蛋白质的大肠杆菌总tRNA纯化方法，其特征在于，所述步骤S2还可以采用凝胶纯化法提取gp5.5蛋白质结合的tRNA，具体步骤为：

(1)将步骤S1收集的含gp5.5蛋白质的洗脱液按照体积比6:1的比例加入6×核酸上样缓冲液，90℃变性1分钟后置于冰上，通过TBE尿素变性胶凝胶电泳，切胶回收tRNA目的条带；加入1-2倍凝胶体积的凝胶洗脱缓冲液，并将胶捣碎后室温旋转洗脱过夜，过滤除去凝胶碎块，得到过滤液；

(2)在上述步骤(1)的过滤液中加入1/10体积3M NaAc混匀后再加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，静置，离心；倒掉上清后加入80％体积的预冷无水乙醇，离心，倒掉上清，晾干后加入适量体积的DEPC水溶解后保存。