[发明专利]用于检测生殖支原体的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒

说明书

本发明提供了用于检测生殖支原体的荧光PCR引物、探针及检测试剂盒。本发明通过对目前已知的所有生殖支原体的基因组进行比对，筛选得到用于检测生殖支原体的多拷贝重复序列基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，并设计了检测其的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ IDNO.4所示。本发明的检测试剂盒检测生殖支原体灵敏度可低至0.5copies，对常见10种其他支原体以及7种生殖道常见病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测生殖支原体的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行生殖支原体检测的方法和试剂盒。

背景技术

生殖支原体(Mycoplasma genitalium)是引起人非淋菌性尿道炎的重要病原，其还是前列腺炎、盆腔炎等泌尿生殖道感染重要病原之一。2015年，美国疾病预防控制中心(CDC)发布了最新版的《性传播疾病治疗指南》(2015Sexually Transmitted DiseasesTreatment Guidelines)，明确了生殖支原体的在性传播疾病中的作用，更加引起临床重视。由于生殖支原体营养要求高、培养周期长，临床标本分离成功率非常低且耗时。此外，生殖支原体的主要外膜抗原粘附蛋白与肺炎支原体外膜粘附蛋白氨基酸序列同源性高，血清学检测存在交叉反应，故血清学方法在检测中存在较大局限性。目前，国内对于生殖支原体临床检测工作开展相对较少，对生殖支原体的诊断能力有限，误诊和漏诊现象普遍存在，给医疗负担和医患关系带来负面效应。对于此类难培养且不适合进行血清抗体检测的病原菌，核酸检测技术凸显出技术优势。最新版的《性传播疾病治疗指南》中明确指出核酸检测技术是生殖支原体检测的首选方法。目前，以荧光PCR检测技术为代表的核酸检测技术，凭借快速、高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于生殖支原体临床感染检测。国内外已报道多种生殖支原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均超过传统的血清学检测和普通PCR检测技术。现有的检测生殖支原体的荧光PCR检测的靶位点均集中在16S rDNA、mg219、MgPa等基因序列，其检测灵敏度在几个拷贝到几十个拷贝之间。

目前报道的检测方法是通过对生殖支原体相关目的基因进行序列比对，在上述目的基因的保守区域中设计引物探针的检测方法。上述16S rDNA、mg219、MgPa等基因在生殖支原体基因组中均为单拷贝基因，意味着每个生殖支原体菌中只含有1个靶序列作为检测扩增的模板。对于检测病原的方法，灵敏度越高，则意味着该检测方法越准确、可靠，因此如何提高检测灵敏度是技术人员一直致力于解决的问题，但目前还未见有检测生殖支原体更高灵敏度方法的报道。如果能在重复序列中寻找保守且稳定的靶序列，并设计探针引物，通过对保守的重复片段扩增，以此提升生殖支原体检测灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测生殖支原体的特异性靶序列；本发明的还在于提供一种检测生殖支原体灵敏度达0.5copies的检测试剂盒。

为实现上述目的，发明人通过NCBI数据库已报道的所有生殖支原体全基因组序列比对，发现了一段保守的MgPar重复序列，该重复序列能够针对生殖支原体MgPar1-MgPar9的9个重复序列其中的6个保守区域作为靶序列。也即本申请筛选到的重复序列保守区存在于生殖支原体基因组的6个不同区域，序列比对结果显示，每一株生殖支原体的上述6个保守区域的该重复序列在不同菌株中均未发生任何突变，该重复序列是保守稳定的区域，可以作为荧光PCR检测靶序列使用。意味着如果针对该重复序列涉及的引物探针能同时扩增生殖支原体的MgPar的6个靶序列，其检测生殖支原体的灵敏度理论上在现有技术针对普通保守序列进行检测的基础上提高了6倍。

本发明提供了用于检测生殖支原体(Mycoplasma genitalium)的靶序列，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。