[发明专利]一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用

说明书

本发明公开了一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Bacillus halodurans S7的嗜热嗜碱木聚糖酶编码基因xyn10A进行倾向错误PCR进行随机诱变，筛选获得单突变体A262T；通过对蛋白底物进口处设计的4点饱和突变，得到3点突变V220N Q251S W254R；然后将两者整合在一起得到4点突变V220N Q251S W254R A262T。所得三株突变体酶表现出了较高的比酶活，分别为野生型酶的2.01、3.41、4.42倍。相比野生型嗜热嗜碱木聚糖酶，本发明的突变体酶更有利于其在工业上的应用，尤其是在低聚木糖制备和在工业造纸助漂方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种比酶活明显提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其在工业中的应用。

背景技术

木聚糖酶(xylanase)是指可以降解木聚糖的一类酶总称。木聚糖是一种多聚五碳糖，结构多样，主要存在于陆生植物、海洋藻类的细胞壁中。由于木聚糖主链聚合度及侧链残基取代具有多样性，单靠某一种酶并不能完全降解木聚糖。依据木聚糖酶主链降解的方式不同，可将木聚糖酶分为三种：β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidases)、内切-β-1,4-D木聚糖酶(endo-1,4-β-Dxylanas)和外切-β-1,4-D-木糖苷酶。另外，降解木聚糖侧链的酶主要有α-D-葡萄糖醛酸酶(α-D-glucuronidase)、乙酰木聚糖脂酶(acetylxylan esterases)、酚酸脂酶(phenol acid esterases)和α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)。总之，木聚糖首先被内切-β-1,4-D木聚糖酶水解，然后再进一步被以上这些酶相互协同水解，才可以得到彻底降解。一般而言，木聚糖酶仅指内切-β-1,4-木聚糖酶。

木聚糖酶的应用涉及到我们生活的方方面面，包括食品、饲料、造纸、能源等，一直是国内外的研究热点。对于嗜热嗜碱木聚糖酶主要是被应用在低聚木糖制备和工业造纸工艺中。最早在1986年，芬兰科学家Viikari首次报道用木聚糖酶处理纸浆，减少了后序漂白过程中含氯漂白剂的用量，从而减少了环境污染。随着木聚糖酶在造纸工业中应用的普及，木聚糖酶的应用方面得到很大的开发，主要包括：1)原材料处理；2)纸浆漂白；3)纤维改性；4)废纸脱墨。用嗜热嗜碱木聚糖酶处理纸浆，不仅可以减少含氯漂白剂的用量及有毒化学物质的排放，同时还可以改善纸张性能，简化了工艺流程、减少了工艺能耗。

本发明人前期研究的嗜热嗜碱木聚糖酶基因来源于Bacillus halodurans S7，含有1119bp的开放阅读框，编码373个氨基酸，将该基因xyn10A在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所得嗜热嗜碱木聚糖酶酶经纯化后再进行酶学性质分析的研究表明，该酶的最适温度为70℃，最适pH为10.0，比酶活为110.00U/mg，可以有效地降解木聚糖，但是其比酶活较低，离工业应用要求还有较大差距，因此通过分子改造方法获得比酶活明显提高的嗜热嗜碱木聚糖酶，对其在工业应用上的推广有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种嗜热嗜碱木聚糖酶突变体，尤其是一种与嗜热嗜碱木聚糖酶的比酶活显著关联的突变位点，以及一种具有更高比酶活的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体及其编码基因和制备方法与应用。

为了实现本发明的技术目的，发明人通过大量试验摸索和研究，最终以野生型嗜热嗜碱木聚糖酶的基因为模板，采用倾向错误PCR、4点饱和突变和定点突变技术获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达，最终获得了一种比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体。

具体来说，本发明是以来源于Bacillus halodurans S7的野生型嗜热嗜碱木聚糖酶基因(SEQ ID NO.7)为模板，采用error-prone PCR进行随机突变，用96孔板筛选得到比酶活提高的嗜热嗜碱木聚糖酶突变体1；突变体1是将核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的野生嗜热嗜碱木聚糖酶的第262位的丙氨酸A突变为苏氨酸T而得。