[发明专利]一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法

说明书

本发明提供一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法，设计了回文序列非荧光标记锁式RCA探针，（1）识别目标部分：能与目标miRNA完全互补，位于锁式探针的3’端与5’端；（2）切割位点部分：限制性内切酶Nt.AlWI的半识别位点，此位点融合了回文碱基片段。其与nicking切割酶结合，提出N‑RCA概念，并发生双向链置换反应（D‑SDA）联用，用于肿瘤标志物miRNA的检测。通过本发明可实现对let‑7a miRNA的高效放大检测，而且经济实惠，有望用于临床诊断试剂盒开发。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法。

背景技术

目前，许多传统放大技术，包括印迹法、实时定量PCR、微阵列法广泛用于miRNA检测。尽管这些方法有其优点，但同时，它们也有很多限制，比如灵敏度不足、严格的温度控制以及需要高昂的实验费用。为了克服以上困难，我们设计了回文序列非荧光标记的锁式RCA探针，结合nicking切割酶，提出N-RCA新概念，并同双向链置换反应（D-SDA）联用，用于肿瘤标志物miRNA的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法，目前还没有回文序列与nicking切割位点协同嵌入而设计的高性能锁式RCA探针，本发明就是利用这一技术开发自动切割-滚环扩增及链置换反应复合型信号扩增体系，用于非标记、高灵敏、高特异检测miRNA等肿瘤标志物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用回文锁式探针检测肿瘤生物标志物的方法，所述的锁式探针：

（1）识别目标部分：能与目标miRNA完全互补，位于锁式探针的3’端与5’端；

（2）切割位点部分：限制性内切酶Nt.AlWI的半识别位点。

（3）所述锁式探针中含有回文序列：3’-CTAGCTAG-5’。

所述锁式探针中含有融入回文序列的可控限制性内切酶识别位点： 3’-CCTAGCTAGA-5’。

具体方法包括如下步骤：

（1）制备含有1μM锁式探针与确定浓度的目标miRNA的T4 连接酶缓冲溶液；

（2）向上述溶液中加入350 U/μL T4连接酶，在16 ℃下进行2小时的连接反应，得到闭合的锁式探针；

（3）在10 μL步骤（2）混合物中加入10 mM 2 μL dNTPs、3 U聚合酶、5 U Nt.AlWI切割酶、0.5 μL 100×BSA、2 μL的10×phi29缓冲溶液与4.7 μL的二次水，在37 ℃条件下孵育反应2小时，确保N-RCA与D-SDA反应充分；

（4）在步骤（3）的混合物中加入2 μL 的10×Sybr Green I，室温下孵育30分钟；接着添加pH 7.4 100 mM PBS至200 μL后，在室温下进行荧光测定即可。

本发明的优点在于：

本发明灵敏度高、特异性好。本方法检测下限低（5 pM）、线性范围宽（5-30 nM），这是本体系取得了N-RCA与D-SDA的协同放大效应；特异性高的原因归功于以下2个因素：(i)只有完全互补的目标miRNA才能使锁式探针特异性连接、闭环；(ii)切割酶Nt.AlWI特异性切割5’-GGATCNNNN↓N-3’。

附图说明

图1、实验原理图。

图2、可行性考察图。

图3、特异性考察图。

图4、复杂环境中检测目标miRNA的能力。