[发明专利]一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒

说明书

本发明提供一种封闭探针介导的ARMS‑ddPCR检测基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括：ARMS引物，与ARMS引物配对进行PCR扩增的下游引物或上游引物，野生型封闭探针，和检测探针。本发明的封闭探针与ARMS引物方向相同，封闭探针与ARMS引物在模板结合区有重叠或者封闭探针不能被水解，从而达到封闭ARMS引物对野生型模板的非特异性扩增的效果。

技术领域

本发明涉及微液滴数字PCR技术领域，具体涉及一种封闭探针介导的ARMS-ddPCR检测基因突变的试剂盒。

背景技术

等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)已在多个文献和专利中进行描述，已知引物3’末端核苷酸是区分是否与目标序列完全匹配的核苷酸，但该核苷酸并不能完全决定扩增特异性，等位基因特异性PCR中的特异性主要是错配引物远远低于完全匹配引物的延伸速度，从而降低了错配目标的相对扩增效率。但该过程是动态平衡的，降低的延伸动力学及由此而来的PCR扩增特异性还受其他许多因素影响：包括酶的错配碱基识别能力、反应组分、退火延伸温度及引物全部序列背景。这些因素对每一个具体引物的影响都可能不相同，无法定量估计。因此，等位基因特异性PCR引物的设计存在很多不确定性，需要大量的反复实验。为了提高扩增特异性，也有报道在除了3’末端核苷酸之外的其他序列位置人为引入错配碱基，从而降低非特异扩增；或者通过引入某些核苷酸的化学修饰来降低非特异性扩增。但这些人工错配碱基或额外的化学修饰在提高扩增特异性的同时，可能会降低完全匹配引物的扩增效率，造成检测灵敏度下降。

随着数字PCR发展，基于微液滴的数字PCR技术(ddPCR)在稀有突变检测中凸显出极大优势，该技术基于微流控芯片，可生成数微米到数百微米的液滴，液滴的体积通常为皮升到纳升级别，可以包裹单分子。为了便于生化反应，微液滴可以是惰性油通过生物相容性的表面活性剂包裹水相的形式。微液滴可以看作皮/纳升尺度的试管，常见的生物化学可以在微液滴中实现。ddPCR独特的优势如下：(1)灵敏度高，一个液滴可包含单个分子或细胞，在物理层面实现单分子级检测；(2)准确性强，每次微流体芯片可生成数百万个微液滴，对逐个微液滴统计，通过泊松分布计算模板数量，可实现数字化，结论可靠；(3)反应全封闭，生化反应局限于惰性油包裹的水相中，不会对下次反应造成污染；(4)全集成，微液滴的生成、融合、注射、分割、计数、分选、检测都是在流体运动中，易于集成；(5)试剂成本低，每次皮升级的进样量可节省昂贵的生物试剂。目前，基于微液滴技术的研究工作和各种应用领域发表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平杂志上。可以预见，随着检测技术的不断改进，敏感性和特异性的不断提高，微液滴技术将在核酸检测和分子诊断领域发挥巨大的应用价值。

近年来，肺癌仍是威胁人类健康的首要恶性肿瘤。据WHO报道，全球肺癌新发病例约161万例，死亡约138万例，分别占恶性肿瘤新发病例及死亡病例的13％及18％，居恶性肿瘤第一位，其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。尽管肺癌的诊断方法和治疗手段不断提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的预后较差，5年生存率仍<20％。我国肺癌发病率和死亡率持续高居首位，每年新增肺癌病例约73万，严重危害大众健康。随着个体化医疗观念的不断深入，精准医疗正逐渐成为肿瘤治疗的新方向，检测特定基因突变可以为医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是近年来肺癌治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，靶向药可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。

研究表明，表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKI)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被证明对具有EGFR激活突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效，EGFR-TKI成为非小细胞肺癌靶向治疗的里程碑。当EGFR酪氨酸激酶区(tyrosine kinase，TK)发生突变时，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期NSCLC患者的有效率达到80％以上。