[发明专利]一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用

说明书

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用，所述探针以双氰基二苯乙烯为母体制备，结构中包含咔唑基、双氰基、正辛基。该探针的分子结构中由于含有较长的柔性链，具有较强的亲脂性，能穿透细胞壁(或细胞膜)进入细胞，对细胞进行染色，从而检测细胞中的pH；并且属于D‑π‑A型分子，提高了双光子吸收截面(δ)，使探针具有较高的成像清晰度与分辨率；另外在标记过程中拥有超大斯托克斯位移，大大提高了成像准确度与精密度，并且本发明探针在溶剂中荧光量子产率(Φ)较高，双光子发射截面较大，则成像的亮度越高，自然越清晰、分辨率也越高。

技术领域

本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子荧光pH探针的制备方法及其在细胞成像中的应用。

背景技术

细胞内的大多数活动都是pH敏感的，包括细胞体积调节、囊泡运输、细胞极化、纤维收缩以及支架的建立。细胞内的pH的改变会影响细胞内的信号传递分子，如Ca²⁺、cAMP的活动，因此影响细胞内信号的传导。细胞内pH值的测定方法主要有弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法，以及目前广泛应用的免疫荧光探针法等。

荧光探针技术经过不断的发展，目前趋于较为成熟，pH值荧光染料有很多种，每种染料又有不同的工作pH区间，广泛采用的有BCECF荧光黄探针和SNARF-1羧化半萘罗丹明类荧光探针。但BCECF法不能用于细胞膜电位的测定，且其在细胞质中更易螯合，增加了染料的浪费和增大了实验误差；SNARF法的实验精度还需要再进一步提高。

本发明人一直致力于对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究，在前期的研究过程中，专利CN200710010784.6、一类双氰基二苯乙烯双光子荧光染料公开了对通用的二苯乙烯类染料结构进行修饰改造合成新型双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料，具体表现为在通用的二苯乙烯染料的同一苯环上引入双氰基，并在说明书中针对双氰基二苯乙烯类双光子荧光染料中代表性化合物的合成方法、使用方法进行了披露。但是，在当时的研究过程中，仅是对该类染料测定溶液粘度、温度、极性变化的方法，以及典型化合物D1-1、D3-1的上述测定结果进行了披露，但其他结构染料的性能及应用并未具体涉及，还需要进一步的验证；同时该专利也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面探测的应用。另外，论文《对苯二甲腈为母体的双光子荧光染料及其探针的研究》也是同一时期针对双氰基二苯乙烯类染料及探针研究的阶段性成果，文中公开了对D-π-A、A-π-A、A-A-A、D-A-D等结构的二苯乙烯类染料的双光子吸收截面、溶解性影响、光物理性质的影响等内容，但也并未提及该类染料在作为细胞汞、锌等离子以及pH等方面检测探针的应用。

在现有技术中，CN201610801435.5(专利1)公开了一种识别线粒体pH的双光子荧光探针，该探针基于双通道检测线粒体中的pH水平，并很好地穿透组织，定位于线粒体中；CN201310326493.3(专利2)公开了一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用，所述探针化合物的双光子吸收截面强，水溶性好，并具有较高的反应活性和很强的配位能力，可应用在银离子检测和pH检测中；

但是，专利1涉及的探针最大发射波长仅456nm，离理想的近红外成像窗口(650-900nm)差距较大，这会给细胞带来光致毒，还会诱导组织自发荧光干扰(短波长长的发射光成为组织中生物荧光分子的激发光)；此外，专利1涉及的探针的荧光量子产率才0.02，这会严重影响检测的灵敏度与成像的清晰度与分辨率。专利2涉及的探针分子体积较大，细胞渗透性严重受影响，专利内容亦未提及用于细胞成像，应该是细胞成像比较困难；另外专利2涉及的探针虽未测定双光子吸收截面，从分子结构可以估计双光子吸收截面不是很大，应该远小本发明的探针的双光子吸收截面；专利2涉及的探针还会受银离子的干扰。