[发明专利]一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法

说明书

本发明公开了一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法。本发明提供的方法，1)将含典型稻瘟病单病斑的水稻叶片涂布在水琼脂培养基表面，得到带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板；2)培养所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板，再于体视显微镜下寻找单个且已萌发的稻瘟菌分生孢子，再分离该稻瘟菌单孢，得到含有稻瘟菌单孢的琼脂块；3)将所述含有稻瘟菌单孢的琼脂块转移至番茄燕麦培养基培养，得到小菌落，在所述菌落周围贴灭菌滤纸片，继续培育至菌落长满培养皿；收集带菌的灭菌滤纸片，得到稻瘟菌单孢菌。本发明极大地缩短从田间稻瘟病斑上分离、保存稻瘟菌单孢的时间，对研究稻瘟菌群体无毒基因型的时空动态有重大的意义。

技术领域

本发明涉及一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法，属于植物保护领域。

背景技术

由稻瘟菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是世界各水稻生产区内广泛发生、且危害极大的一种真菌性病害。每年由稻瘟病造成的水稻产量损失约占其总产量的5％；在极端条件下，稻瘟病会造成水稻绝产。稻瘟菌可以侵染水稻的根、叶、穗等各个部位，在水稻整个生育期内均可侵染。此外，稻瘟菌寄主范围非常广泛，还可侵染大麦、小麦等禾本科植物。

目前防治水稻稻瘟病的主要措施有栽培抗稻瘟病品种和使用杀菌剂。一方面，国家在大力提倡绿色植保工程，需要减少杀菌剂的用量，采用环保的措施进行病害的防控。另一方面，由于田间稻瘟菌无毒基因的快速变异，能导致抗病水稻品种在推广几年后就失去抗性。因此，了解并掌握田间稻瘟菌无毒基因型的组成、分布及其变异规律，才能为抗病水稻品种的合理布局提供基础，进而对稻瘟病进行绿色防控。为此，科研人员需要从田间分离大量的稻瘟菌单孢菌株，以便检测不同稻瘟菌菌株的致病力、致病型和杀菌剂抗性等性状。目前，现有的稻瘟菌单孢分离方法操作周期长、操作过程复杂、易受其它杂菌的污染，这些因素极大地制约了科研人员研究稻瘟菌群体无毒基因型时空动态的进度和水平。因此，急需要一种能快速地从田间稻瘟病斑上分离稻瘟菌单孢的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从田间稻瘟病斑上分离稻瘟菌单孢的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将含典型稻瘟病单病斑的水稻叶片(或者用剪刀剪下的含典型单病斑的适宜大小叶片)涂布(涂布采用的力道适中，避免孢子收集过密或过稀)在水琼脂培养基表面，得到带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板；该步骤可以直接田间操作。

2)培养所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板，再于体视显微镜下寻找单个且已萌发的稻瘟菌分生孢子，再分离该稻瘟菌单孢，得到含有稻瘟菌单孢的琼脂块；

3)将所述含有稻瘟菌单孢的琼脂块转移至番茄燕麦培养基培养，得到小菌落，在所述菌落周围贴灭菌滤纸片，继续培育至菌落长满培养皿；收集带菌的灭菌滤纸片，得到稻瘟菌单孢菌。

上述方法中，步骤1)中所述水琼脂培养基还包含以下成分：50微克/毫升盐酸四环素、20微克/毫升卡那霉素、50微克/毫升硫酸链霉素和20微克/毫升氯霉素。

上述方法中，步骤2)中所述体视显微镜的最大放大倍数不低于100倍。

上述方法中，所述体视显微镜的放大倍数为160倍。

上述方法中，步骤2)中，所述培养所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板的时间为2-3小时、培养温度为26度，光照度为15000勒克斯；

或，所述分离稻瘟菌单孢的方式为划“方形”琼脂块的方式，一般可在拖划区域边缘寻找到可供挑取的单个稻瘟菌孢子；且挑针划线形成的“方形”琼脂块体积应越小越好，可降低杂菌污染概率。

上述方法中，步骤2)，若不能及时地进行分离稻瘟菌单孢，则将所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板置于4度冰箱中保存，可于一周内进行稻瘟菌单孢分离实验。