[发明专利]一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法

说明书

本发明涉及一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法，尤其是注射用重组人尿激酶原降解物(降解产物大约为20kDa～36kDa)和多聚体(二聚体大约为100KDa～140KDa)，中间体及其降解物，本发明所述方法采用梯度凝胶电泳检测方法，其检测条件是所用梯度胶为聚丙烯酰胺凝胶，电泳时所用的缓冲液为MOPS缓冲液，其中，所述梯度胶为含4‑12％Nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4‑20％Surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，所述MOPS缓冲液为1×MOPS缓冲液。

技术领域

本发明属于医药领域，尤其是涉及一种注射用重组人尿激酶原杂质分析的梯度电泳检测方法。

背景技术

尿激酶原是尿激酶的前体，是一种糖蛋白，由411个氨基酸组成，其本身无活性，经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之间的肽链打开形成尿激酶，才能发挥其溶血栓的效能。是一种特异性的溶血栓的药物。

上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达获得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗，已于2011年作为国家一类新药成功上市。

普佑克(重组人尿激酶原制剂)的组成见CN1730098A(申请号为200410058006.0)。该制剂主要由尿激酶原和人血白蛋白组成，其分子量分别为50±5.0KDa和66KDa，比例约为1:1.2。普佑克成品及纯化中间体的杂质分析结果可知，成品在稳定性研究过程中容易发生降解(降解产物大约为10kDa～40kDa)和多聚体(二聚体大约为100KDa～150KDa)，且纯化中间体中也会含有一些降解物。因此，在生产过程以及工艺优化过程中，杂质一直是质量控制的关键点。

2015年12月11日，上海天士力药业有限公司亦申请了普佑克的电泳检测方法，该方法见CN106872551A(申请号为201510919364.4，以下简称2015年专利)，包括以下步骤：1)供试品溶液的制备：取注射用重组人尿激酶原于冰上融化，MilliQ水稀释，加入非还原样品缓冲液后，置于55-65℃加热1-5分钟，立即置于冰浴中，得非还原态供试品溶液，2)Marker溶液的制备：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分钟，立即置冰浴备用；3)测定方法：采用垂直板凝胶电泳系统，对供试品溶液和Marker溶液进行检测，两种溶液的上样量为10-20μl，仪器初始电压为50-60V，进入分离胶时调整电压100-110V，当溴酚蓝条带跑到凝胶下边缘时，电泳结束，电泳后分别染色、脱色、得到图谱，根据图谱计算供试品溶液纯度。

2015年专利中检测的标本是注射用重组人尿激酶原，里面的辅料人血白蛋白的分子量是66KD左右，重组人尿激酶原的分子量是50±5KD,两者的分子量很接近，2015年专利提供的SDS-PAGE法使用15％分离胶，5％浓缩胶进行检测，可以很好的将60kDa以下的蛋白分离，但是无法检测到100～140Kda的二聚体蛋白，也无法将尿激酶原与人血白蛋白(辅料)有效分离，故需建立新的方法进行纯度和杂质分析检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种注射用重组人尿激酶原的梯度电泳杂质分析方法。该方法灵敏度高，分离效果好，适合产品的杂质分析，为产品质量监控提供更有力的依据。

本发明是在现有技术基础CN106872551A上的改进发明。

本发明提供一种注射用重组人尿激酶原杂质检测方法，所述方法采用梯度凝胶电泳检测方法，其检测条件是所用梯度胶为聚丙烯酰胺凝胶，电泳时所用的缓冲液为MOPS缓冲液。

优选地：所述梯度胶为含4-12％Nupage分布的聚丙烯酰胺凝胶或含4-20％Surepage分布的聚丙烯酰胺凝胶，可以通过市售直接购买。