[发明专利]酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法

说明书

本发明提供一种酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法。所述酶膜包括基底层、以及自基底层一表面向外依次叠设的酶层、抗干扰层。所述糖化血红蛋白的检测方法，将上述酶膜贴附于过氧化氢电极的银片表面；将糖化血红蛋白样品加入含有非离子表面活性剂和蛋白质羧基修饰剂的溶血剂中，获得样品液；以前述过氧化氢电极对样品液进行检测并经采集器采集检测数据，随后进行放大处理，最后由计算机计算出所述样品液中糖化血红蛋白的浓度。该发明的酶膜具有良好的生物相容性，并且能够牢固的将酶层进行附着，确保昂贵的蛋白分解酶与氧化酶可以长期重复使用，将其与过氧化氢电极结合后用于糖化血红蛋白的测试时，具有快速、准确、可重复使用等特点。

技术领域

本发明属于糖化血红蛋白的检测技术领域，具体涉及一种酶膜及其制备方法、糖化血红蛋白的检测方法。

背景技术

正常血红蛋白有3种：血红蛋白A(HbA)、血红蛋白F(HbF)、血红蛋白A2(HbA2)，而在成人细胞中主要含有HbA。

使用层析法分离血红蛋白时，可洗脱出3中含糖成分：HbA1a、HbA1b和HbA1c，这些含糖成分统称为糖化血红蛋白(GHb)。其中，糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中红细胞内血红蛋白与血糖结合的产物。自20世纪70年代末期，常规实验室常以HbA1c作为检测项目，并且稳定发展至今。通过检测HbA1c，可以作为糖尿病控制是否良好的重要指标。现在国外已经将糖化血红蛋白监测作为糖尿病疗效判定和调整治疗方案的“金指标”。近年来有许多报道表明：HbA1c在冠心病、心肌梗死、脑梗死等疾病的诊治方面亦有很重要的临床价值。

目前HbA1c的检测方法主要有高效液相色谱法、硼酸亲和层析法、免疫法和酶法。其中，高效液相色谱法是采用C18反相HPLC进行初分离，0.1％的三氟乙酸-乙腈为洗脱液进行梯度洗脱，收集并冻干15～18min时间区间内得到的洗脱成分(糖基化和非糖基化β链氮端六肽的混合物)。冻干成分溶解于少量0.01％的三氟乙酸水溶液，并注入CE柱，在电压为25kV、温度为20℃、缓冲液为H₃PO₄/NaH₂PO₄(pH＝2.5)的条件下进行精细分离，根据214nm吸收峰测定糖基化以及非糖基化β链氮端六肽的相对含量。该方法具有高度的特异性，能排除包括镰刀型血红蛋白(hemoglobin S，HbS)、血红蛋白C(hemoglobin C，HbC)、胎儿血红蛋白(fetalhemoglobin，HbF)以及氨基甲酰化Hb等的干扰，能反应HbA1c的真实含量。

亲和层析法测定GHb含量的基本原理是采用氨基苯硼酸与固定相基质(如琼脂糖或聚丙烯胺等)交联作为分离介质，利用硼酸基团所携带的羟基与血红蛋白糖化所形成的顺位二元醇可逆结合，将GHb绑定在分离介质上，使其与非糖化血红蛋白分离，绑定的GHb成分通过山梨醇洗脱，其含量通常采用光谱法测定。由于亲和层析中硼酸基团并非针对HbA1c特异性绑定，除HbA1c外，其他位点的糖化产物同样能够与硼酸结合绑定，因此该法的检测对象为GHb。

免疫检测法是基于糖化与非糖化血红蛋白结构差异而设计的检测方法。其基本原理是采用较已知浓度过量的HbA1c抗体与其特异性结合形成可溶性复合物(免疫复合物)，通过测定该复合物的浓度直接表征HbA1c含量或通过测定剩余抗体含量间接表征HbA1c含量。

酶法测定HbA1c的基本原理和实验流程可大致分为三步。a.酶解：HbA1c经酶解反应，其β链糖基化的氮末端水解生成果糖基缬氨酸(fructosyl valine，FV)或果糖基缬氨酸组氨酸复合物(fructosyl valyl histidine，FVH)；b.酶催化：果糖基氨基酸复合物(FV、FVH)经FAOX、FPOX催化氧化产生过氧化氢；c.H₂O₂的测定：体系中产生的H₂O₂在过氧化物酶的存在下与显色剂产生显色反应，通过测定吸光度值求出HbA1c的百分浓度。该方法精密度好，与HPLC和免疫法均有良好的相关性。