[发明专利]一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法

权利要求书

1.一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，通过在木葡萄糖酸醋杆菌菌种扩培阶段向发酵罐中添加磁性固定化纤维素酶来实现；扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除；所述磁性固定化纤维素酶的载体为磁性纳米粒子。

2.如权利要求1所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子包括磁性的金属纳米粒子、金属氧化物纳米粒子中的至少一种。

3.如权利要求2所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述金属纳米粒子为Fe、Co、Ni中的至少一种；所述金属氧化物纳米粒子为Co₃O₄、Mn₃O₄、Fe₂O₃、Fe₃O₄中的至少一种。

4.如权利要求1所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述磁性固定化纤维素酶的粒径为30～220nm。

5.如权利要求1所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述磁性固定化纤维素酶的添加量为发酵液中浓度10～200U/mL。

6.如权利要求5所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述磁性固定化纤维素酶的添加量为发酵液中浓度50-150U/mL。

7.如权利要求1所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)配制培养基

菌种活化、菌种扩培所用培养基组成为(g/L)：葡萄糖25，酵母粉7.5，胰蛋白胨10，磷酸氢二钠10，冰乙酸调pH至6.0，115℃灭菌30min；

(2)制备磁性纳米粒子

(3)制备磁性固定化纤维素酶

将磁性纳米粒子加入含有8mg/mL碳化二亚胺的去离子水中，超声分散3min；将混合物于4℃冰箱放置30min，然后加入纤维素酶，超声3min；反应体系于4℃冰箱放置24h，每8h超声3分钟；然后用磁铁将固定化酶沉降，用去离子水冲洗沉淀3次，真空冷冻干燥，于4℃保存；磁性纳米粒子与纤维素酶的质量比10-20:1；

(4)菌种活化

挑取一环斜面菌种接种至摇瓶培养基中，30℃180r/min活化24h；

(5)菌种扩培

取磁性固定化纤维素酶用去离子水配成溶液，经0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤除菌后加入发酵罐，使发酵液中纤维素酶浓度为100U/mL；接种活化后菌种，发酵罐温度为30℃，转速为80-180r/min，通气量0.2-0.8vvm，培养时间12h-48h；

(6)磁性固定化纤维素酶的去除

扩培结束后，通过外加磁场将磁性固定化纤维素酶去除，磁场强度为0.1T-10T；

(7)菌体量测定

取发酵液离心收集菌体，用生理盐水洗3遍，60℃烘干测定菌体干重。

8.如权利要求1-7任一所述的一种大量获得木葡萄糖酸醋杆菌菌体的方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子为纳米Fe₃O₄，制备方法如下：在氮气氛围下将摩尔比2:1的Fe³⁺与Fe²⁺溶于去离子水，加入质量百分比0.5％-1.0％的PEG4000，剧烈搅拌，向体系中逐滴缓慢加入氨水溶液至pH为11，保持剧烈搅拌40-80℃水浴20-40min，超声分散20-60分钟，然后于80℃熟化1h，然后用磁铁沉降，去离子水清洗沉淀至中性，真空干燥。