[发明专利]一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片及其应用

说明书

本发明提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片，包含固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含：SEQ ID NO：1‑2所示探针、SEQ ID NO：3‑4所示探针、SEQ ID NO：5‑6所示探针、SEQ ID NO：7‑8所示探针，分别用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪δ冠状病毒。本发明还提供了一种同步检测4种猪腹泻性病毒的试剂盒及检测方法。本发明芯片及方法，可实现四种猪腹泻病毒PEDV、TGEV、GAR与PDCoV的高通量共检，可应用于临床疫病的大量检测，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同步检测4种猪腹泻性病毒的寡核苷酸芯片及其应用。

背景技术

近年来，猪传染性腹泻疾病的发生与流行日益严重，给广大养殖户造成了难以估量的经济损失。目前在我国猪传染性腹泻疾病的病毒原主要是猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、猪A群轮状病毒(Group A rotavirus，GAR)。这三类病毒所引起的疫病发生后外观特征基本相似，均表现为呕吐、水样喷射腹泻和脱水等，特别是哺乳仔猪发病严重且死亡率高。猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)于2012年首次在香港被报道出有猪场发现该病毒，随后于2014年在美国俄亥俄州和伊利诺伊州报道出有猪场发现该种病毒，此后至少有19个州都有该种病毒的报道。PDCoV主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎病伴随有小猪的腹泻和呕吐。由于腹泻病毒常常出现混合感染的情况，且临床鉴别诊断较困难，开展四种猪腹泻病毒的同步鉴别诊断对防控具有重要意义。

目前，针对病毒性疾病的诊断方法主要有病毒分离鉴定、血清学方法(免疫电镜法、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA))以及分子生物学检测技术(原位杂交(ISH)、聚合酶链式反应(RT-PCR))等，这些方法虽然得到了一定的应用，但在诊断混合感染中仍然存在不足。例如病毒分离不易成功，血清学检测灵敏性低，检测过程中容易出现交叉反应，分子生物学检测的样本数量有限导致无法实现样品高通量的快速检测。这些检测技术的共同缺陷是无法同步，因此急需一种高通量诊断技术来鉴别诊断四种仔猪病毒性腹泻病。

基因芯片技术是近年来迅速发展起来的一门新型的高通量检测技术，根据探针的不同可分为cDNA芯片与寡核苷酸芯片。基因芯片通过将设计好的探针点制在基片上，通过荧光素或酶等标记物标记在扩增产物的单链上与制备完成的芯片进行核酸杂交，然后经过激光扫描仪扫描、肉眼观察等方法得出杂交结果并对其进行分析。该方法具有自动化、平行性和高通量等潜在优势，能同时对多种疾病进行检测，因此它广泛应用于生物学领域，在动物疫病研究方面前景广阔。

目前利用基因芯片技术检测猪腹泻病毒的报道见滑翔等，检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的构建，畜牧兽医学报，2015，12:235-224，该方法仅针对三种猪腹泻病毒，使用的芯片为cDNA芯片，最低检测质量浓度仅为20pg·μL^-1，灵敏度较低。

马锐等，猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用，农业生物技术学报，2016,24:1233-1242，公开了一种寡核苷酸芯片，该方法同样仅能检测三种特定的猪腹泻病毒；而且在操作程序上，步骤多且复杂，条件难以控制和标准化；另外对试剂材料的需求多，检测成本高；并且为了使结果肉眼可见，该方法必须使用喷样，一次性检测的样品数少。

寡核苷酸芯片通过设计特定寡核苷酸片段固定在醛基上，并用荧光标记后PCR扩增所得到的基因片段，通过碱基相互配对与荧光标记进行检测。因为探针以单链的形式固定在基片上，因此相较于cDNA芯片该方法有效的降低了双链竞争抑制作用，杂交效率及灵敏度一定程度上均优于cDNA芯片。但目前并无对猪腹泻病制备寡核苷酸芯片的报道，更未见同时检测4种猪腹泻病毒的高灵敏性寡核苷酸芯片。

发明内容