[发明专利]一种应用表位多肽建立的鸡新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种应用表位多肽建立的鸡新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述试纸条的底层为PVC板构成的支撑层，该支撑层上依次黏附有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，其中金标抗体结合垫上吸附有胶体金标记的多肽P25，硝酸纤维素膜上喷涂有兔抗鸡IgG溶液印制的检测线和新城疫病毒多肽P25表位抗体溶液印制的质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm，多肽P25的氨基酸序列为Thr CysPro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Leu Arg Met Ala。

2.根据权利要求1所述的一种应用表位多肽建立的鸡新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于：所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2mm，金标抗体结合垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm，吸收垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm。

3. 一种权利要求1所述的一种应用表位多肽建立的鸡新城疫病毒抗体免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）鸡新城疫病毒高免血清的制备

将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获新城疫病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化新城疫病毒，以1mg/mL的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清，用多肽P25通过ELISA方法检测抗体滴度，并将收集到的血清于56℃灭活30min，于-70℃保存备用；

（2）多肽P25表位抗体的制备

根据SulfoLink® Immobilization Kit试剂盒将多肽P25稀释至500μg/mL并标记免疫亲和层析柱，将制备的鸡新城疫病毒高免血清通过免疫亲和层析柱，最后用洗脱液洗脱多肽P25表位抗体，重复2-3次，将收集到的多肽P25表位抗体于-20℃保存备用；

（3）金标抗体结合垫的制备

向100mL pH=7.5的胶体金溶液中加入多肽P25溶液，混匀后，RT温育30min，加入10wt%BSA至其终浓度为1wt%，混匀后，RT孵育10min，4℃，12000r/min离心25min，弃上清，沉淀用10mL重悬液进行重悬，充分吹打后于4℃保存备用，其中重悬液包括20mM Na₂B₄O₇、1wt%BSA、2wt%蔗糖、0.1wt% Triton X-100和0.1wt% NaN₃，余量为去离子水；

（4）硝酸纤维素膜的制备

将新城疫病毒多肽P25表位抗体和兔抗鸡IgG分别用PBS稀释到1mg/mL按1μL/cm均匀喷涂到硝酸纤维素膜上作为质控线和检测线，检测线和质控线相距5mm位于硝酸纤维素膜的中心，室温自然干燥，封装后于4℃保存备用；

（5）试纸条的组装

将胶体金标记多肽P25吸附于结合垫上得到金标抗体结合垫，再将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按次序保持2mm的重叠宽度后粘贴至PVC板构成的支撑层上，然后裁切为宽度为4mm的长条状试纸条，再将试纸条装入试纸卡中，放入烘烤箱中干燥保存备用。