[发明专利]基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统与装置

说明书

本发明提供了一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统及装置，所述测序系统包括引物、待测DNA模板、多色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；所述引物固定在流通池反应器表面；将待测DNA模板与测序引物进行杂交，然后用多色荧光可逆终止核苷酸延伸引物后，检测延伸引物的荧光信号即可得到待测DNA序列信息；所述待测DNA模板的3’端不需要标记定位荧光。本发明通过利用测序循环过程中，延伸反应物的荧光作为下一次延伸的定位荧光，或采用固定在流通池反应器表面的定位荧光标记物作为定位荧光，无需对待测DNA模板的3’端标记定位荧光，从而有效避免了由于淬灭而导致定位信息丢失的问题，可进一步大幅延长测序读长并降低错误率。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种基于多色荧光可逆终止核苷酸的DNA单分子测序方法与装置。

背景技术

人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing) 是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟 嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具 有重要意义。

DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也是显而易见 的。比如测序时间长、DNA扩增可能引入一定的错误率等。因此，基于单分子的三代测 序技术近年来得到了高度重视和发展，以弥补现行的二代测序技术的不足。

目前，单分子测序技术主要基于两种不同的原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合成延 伸，结合单分子荧光测量来获取DNA分子中的碱基信息(Helicos与PacificBio)。虽然 通过5′-标记荧光技术(PacificBio)可以实现较长的一次性读取，但其检测方式复杂，准 确度有所不足。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有较高的准确性。 读取系统相对简单，实现高通量、低成本的单分子直接测序而不需通过放大等步骤。而 这样方法的关键是实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的长期循环延伸，从而实现准 确和较长的序列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有尤其独特的优势， 对临床检测和基础研究都具有重要意义。

目前文献已经公开的单分子测序方法，最引人注目的是，文献(Nat.Methods2009， 6,593-595.)报道的Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing，在 该文献中，为了在单分子测序中实现一次测序循环只能延伸一个可逆终止剂的目的，设 计合成了结构非常复杂的虚拟终止剂，而这样的结构导致在聚合酶作用下，延伸反应很 慢，并且延伸的错误率较高。而在此之前，文献(Science,2008,320,106-109.)报道一 次测序循环可延伸一个、两个甚至三个二硫键可逆终止剂，但不能做到一次测序循环只 能延伸一个可逆终止剂。

在单分子测序中，通过可连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止剂， 其电子效应与空间位阻在DNA延伸、断裂可连接单元以便除去荧光素等过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定测序的效率、读长等关键指标。基于二硫键连接单 元的可逆终止剂在单分子测序中已得到应用，然而文献(Nucleic Acids Research,2008,36,No.4e25)报道基于二硫键的可逆终止剂为单色荧光标记四个不同碱基的核苷酸， Helicos公司为了确保二硫键可逆终止剂作为单分子测序试剂一次只延伸一个可逆终止 剂，在荧光素旁边又连接了一个位阻很大的核苷一磷酸或者二膦酸的inhibitor，该类可 逆终止剂的确能够做到一次测序循环只延伸一个，然而其合成路线繁杂，同时大的位阻 造成参与DNA链延伸时延伸速度慢、错配率高(Michael L.Metzker；Nature Reviews Genetics2010,11,31.)。