[发明专利]CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA

说明书

本发明公开了CRISPR/Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性sgRNA。首先是获得特异性靶向SANIL1基因外显子的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其次是构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，该系统含有Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9病毒感染人细胞，获得SANIL1蛋白表达水平显著降低的细胞株。本发明具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好、且对SANIL1基因切割效率高；此外，所构建的CRISPR/Cas9慢病毒系统具有敲除效率高的优势，并能特异性敲除SANIL1基因，得到敲除SANIL1基因的人细胞，从而为进一步研究人细胞中SANIL1的作用机制提供强有力的工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA。

背景技术

SANIL1(snail family transcriptional repressor 1)：是锌指转录抑制子，下调中胚层中的外胚层基因。由该基因编码的核蛋白在结构上和果蝇snail蛋白类似，而且同样也被认为在发育中的胚胎的中胚层形成是至关重要的。在2号染色体上，人们已经发现了至少2种类似的加工过的假基因的突变体。

Snail1蛋白是锌指蛋白Snail超家族的成员,具有强大的EMT诱导能力。借由其羧基末端的锌指结构与CDH1核心启动子区的E-box基序结合,Snail1蛋白能有效遏制后者的转录表达,造成E-cadherin表达缺失,诱导EMT发生。

CRISPR-Cas系统是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为spCas9识别位点，是实现剪切功能的关键。sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9特异性敲除目标基因的先决条件，脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9对目标基因的特异性敲除，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术。

本发明利用CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得敲除SANIL1基因的人细胞，为研究肠癌细胞中SANIL1的作用机制提供有力工具。

参考文献：

1.Doudna，J.A.；Charpentier，E.，Genome editing.The new frontier ofgenome engineering with CRISPR-Cas9.Science，2014，346，(6213)，1258096.

2.Fang，R.；Chang，F.；Sun，Z.-L.；Li，N.；Meng，Q.-Y.，New Method of GenomeEditing Derived From CRISPR/Cas9.Acta Agronomica Sinica，2013，40，(8)，691.

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向敲除SANIL1基因的sgRNA序列；本发明的另一目的在于提供所述一种靶向敲除SANIL1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统的应用；本发明的再一目的在于提供靶向敲除SANIL1基因的人细胞的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种靶向敲除SANIL1基因的sgRNA序列，选自DNA序列如下的SANIL1sgRNA：