[发明专利]抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用

说明书

本发明公开了一种抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。该木聚糖酶的DNA序列选自：a）含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA序列，或b）编码SEQ ID NO.1所示蛋白序列的DNA序列，或c）在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链；设计对应的引物序列，构建了含该序列的表达载体和重组宿主菌；从宿主菌中分离得到抗抑制性木聚糖酶。本发明的抗抑制性木聚糖酶稳定性好，对XIP‑I具有强烈抗性，在抗XIP‑I型抑制蛋白和面粉加工领域有着广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的30%左右，可以被降解为低聚木糖、阿拉伯糖等，也可以被转化为生物燃料乙醇、丁醇等有用物质，因此被称作自然界中继纤维素后第二丰富的再生资源。木聚糖作为麸皮、小麦等谷物饲料中主要抗营养因子，它的完全水解需要木聚糖酶系的共同参与，其中内切β-1,4木聚糖酶能够对木聚糖的主链骨架结构之间的β-1,4糖苷键进行切割，因此被认为在木聚糖的水解中起着关键的作用。

木聚糖酶的来源十分广泛，在植物、昆虫、微生物中均能发现其踪迹。然而其主要来源于能致植物病的细菌和真菌。

依据其催化结构域氨基酸序列的同源性以及疏水簇的分析，将木聚糖酶划分为糖苷水解酶第10以及第11两个家族。这两个家族的酶在结构、等电点、底物特异、水解速率等方面均存在着较大的差异。GH10家族木聚糖酶主要由α-螺旋与β-折叠组成，呈现“salad”碗状，其底物结合缝隙位于碗状结构的中间。GH10家族木聚糖酶降解木聚糖的速率较快，并且能够降解纤维寡糖及其衍生物。GH11家族木聚糖酶通常由1个α-螺旋与多个β-折叠组成，整体呈现出右手半握状的形态，可细分为“手指”、“手掌”、“thumb”结构等区域。GH11家族木聚糖酶水解木聚糖的速率相对较慢，并且对底物有较高的特异性，被称作是真正的木聚糖酶。

木聚糖酶在食品加工、饲料生产、医药工程和造纸工艺等方面。其中，木聚糖酶在饲料生产中的应用较为广泛，它能显著地提高对木质纤维素物质的利用。麸皮、小麦等大多作为饲料的原料，其中含有大量的非淀粉类多糖，不能被非反刍动物消化吸收，反而加大消化道中的食糜体积，增加粘度，影响饲料的转化率。在饲料中适当的加入木聚糖酶等酶制剂，能够降解可溶性多糖，增强动物对营养物质吸收的能力，从而提高饲料的利用率，提高动物的生产性能。

然而，木聚糖酶的活性往往受到多方面因素的影响，例如酶的热稳定性，动物体内的蛋白酶等。近年包括发明人等的研究发现，在小麦等谷类植物中存在能够抑制木聚糖酶活性的蛋白类酶抑制剂——木聚糖酶抑制蛋白，从而严重影响木聚糖酶催化降解木聚糖的效率。由于木聚糖酶抑制蛋白存在的普遍性与持久性，因此动物饲料配制或谷物加工过程中添加的木聚糖酶的作用效果会受到木聚糖酶抑制蛋白的影响，从而影响饲料质量或加工效果；谷物中抑制蛋白的存在会降低木聚糖酶降解木聚糖的效果，从而限制了饲料利用率及动物生产效率；面包烤制过程中，小麦中抑制蛋白的存在会抵消木聚糖酶增大面包体积的效果；谷朊粉-淀粉分离过程中，抑制蛋白会降低谷朊粉和淀粉的分离效率。

因此，亟需研发一种热稳定性好的木聚糖酶，以便在木聚糖酶的应用领域上提高酶的作用效率，从而降低经济成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性且稳定性好的抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术思路：