[发明专利]一种通用引物单荧光分子检测技术及试剂盒

说明书

本发明提供了一种多重数字PCR检测方法及引物、探针和试剂盒。本发明将通用引物与多重数字PCR进行结合应用，开发出了一种新的核酸检测方法，至少实现了微量、灵敏、精准度高的高通量多重核酸的检测特别是转基因的检测。此外，本发明通过对通用引物种类、浓度以及各修饰特异引物浓度等因素进行优化，建立了一套通量高、特异性强的多重转基因成分筛查检测体系或试剂盒。通过对该体系特异性的验证，确保该检测体系可以满足我国进口口岸的各类转基因成分检测的需要。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种通用引物单荧光分子检测技术及试剂盒。

背景技术

随着转基因技术的发展，越来越多的转基因作物品系被批准。截止2017年，全世界范围内已经有488个转基因事件(GM events)被批准。现在已经报道的文献中，对于转基因成分的检测中，大多数采取的是直接针对某个转基因事件的特异性检测方法。越来越多被批准的转基因事件给事件特异性检测方法带来了极大的挑战。目前多采用先通过筛选方法初步筛选出哪些样品含有转基因，之后再对这些已经初步筛选过的样品进行事件特异性检测，但筛选过程和特异性检测过程没有高效有机的结合起来，转换过程费时费力。高通量筛选方法是一种针对多样品的高通量筛选手段，目前常用的高通量筛选方法有多重PCR技术。多重PCR反应体系中有两对或多对引物，同时针对多对目标序列进行扩增，来获得多对目的产物。但是这种技术在应用中，往往多对不同的引物之间存在相互干扰和抑制作用，将会对实验结果产生干扰，常常产生假阳性的结果。

因此，急需开发一种可同时高效的进行广谱性筛选和特异性检测的方法、反应体系或试剂盒，以实现广谱、微量、灵敏、精准度高的高通量多重核酸筛查和特异性检测，特别是转基因产品的广谱筛查和高特异性检测。

发明内容

本发明提供了一种通用引物单荧光分子检测技术及试剂盒。本发明通过设计通用引物，进一步创造性的将通用引物与多重数字PCR进行结合应用，开发出了一种新的核酸检测方法，至少实现了广谱、特异、微量、灵敏、精准度高的高通量多重核酸的检测特别是转基因的检测。

本发明的一个目的是提供一种分子检测方法,所述方法包括多重数字PCR反应，所述多重数字PCR反应的反应体系中，包括一对以上用于扩增不同待测分子的特异引物对，所述方法还包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)所述反应体系中的所有特异引物对中的每条引物均包括一段核苷酸序列相同的核酸片段Ⅰ；所述反应体系中还包括通用引物，所述通用引物的核苷酸序列中也包括所述核酸片段Ⅰ；

为方便表述和清楚的解释本发明技术方案，所述Ⅰ单纯用于描述或命名，不用于限定所述核酸片段的核苷酸序列，也不用于排序或编号；

具体的，所述核酸片段Ⅰ位于所述特异引物对中的每条引物的5'末端；

具体的，所述核酸片段Ⅰ包括3bp以上的核苷酸序列；再具体的，所述核酸片段Ⅰ包括6bp以上的核苷酸序列；还具体的，所述核酸片段Ⅰ包括19bp以上的核苷酸序列；

具体的，所述核酸片段Ⅰ为序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列；或将序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

具体的，所述通用引物为序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列；或将序列表中SEQID№：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

2)所述特异引物对包括上游引物和下游引物；所述反应体系中的所有特异引物对的上游引物包括一段核苷酸序列相同的核酸片段Ⅱ；所述反应体系中的所有特异引物对的下游引物也包括一段核苷酸序列相同的核酸片段Ⅲ；所述反应体系中还包括通用引物对，所述通用引物对的上游引物的核苷酸序列中包括核酸片段Ⅱ，所述通用引物对的下游引物的核苷酸序列中包括核酸片段Ⅲ；