[发明专利]一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒在审
| 申请号： | 201810130877.0 | 申请日： | 2018-02-08 |
| 公开（公告）号： | CN108318696A | 公开（公告）日： | 2018-07-24 |
| 发明（设计）人： | 朵红;付永;何轶群;沈秀英;郭志宏;彭毛;李伟 | 申请（专利权）人： | 青海省畜牧兽医科学院 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68 |
| 代理公司： | 长沙星耀专利事务所(普通合伙) 43205 | 代理人： | 许伯严 |
| 地址： | 810016 青海*** | 国省代码： | 青海;63 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 细粒棘球蚴病 单克隆抗体 抗原检测试剂盒 原核表达载体 蛋白 离心收集菌体 预包被酶标板 杂交瘤细胞株 大肠杆菌 底物显色液 细菌裂解液 阳性对照液 样品稀释液 阴性对照液 超声破碎 蛋白免疫 定性检测 基因cDNA 检测试剂 抗体来源 离心收集 酶结合物 灵敏度 试剂盒 洗涤液 终止液 抗原 单抗 构建 抗体 分泌 制备 溶解 克隆 基因 生产 | ||
1.一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：所述检测试剂盒包括抗EgAgB8/2蛋白的单克隆抗体预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。
2.根据权利要求1所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：所述抗EgAgB8/2蛋白的单克隆抗体是通过以下方法制备的：首先用RT-PCR扩增EgAgB8/2基因cDNA，克隆EgAgB8/2基因，构建原核表达载体pET-EgAgB8/2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，用IPTG诱导原核表达载体表达，离心收集菌体，用细菌裂解液溶解后超声破碎，离心收集上清，用Ni-NTA胶进行纯化，用纯化的EgAgB8/2蛋白免疫BALB/c小鼠，获得能稳定分泌抗EgAgB8/2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，选择优异的单抗，生产抗体并进行纯化。
3.根据权利要求2所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：将纯化的抗EgAgB8/2蛋白的单克隆抗体用pH 8-10的碳酸盐缓冲液稀释至8-12ug/ml，包被酶标板,每孔60-120ul/孔，3-8℃过夜,用洗涤液洗2-5次，每次3-5min，甩干，加入含2-8％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，每孔100-300ul/孔，并置于30-40℃温箱内封闭0.5-1.5h，取出甩干，洗涤液洗涤2-5次，每次2-5min，甩干，真空包装后置于4℃保存备用。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于所述样品稀释液为含0.02％-0.08％Tween-20磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：阴性对照液为健康未患棘球蚴病的羊的血清，所述阳性对照液为确诊有棘球蚴感染的羊的血清。
6.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG。
7.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：所述洗涤液为含0.02％-0.08％Tween-20磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：底物显色液包括A溶液和B溶液,A溶液的配方为：每500ml含醋酸钠10-15g、柠檬酸1-2g和30％双氧水0.1-0.5ml；溶液B的配方为：每500ml含乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5g、柠檬酸0.5-1.5g、甘油30-70ml和TMB粉末0.1-0.2g。
9.根据权利要求1至3任意一项所述的动物细粒棘球蚴病ELISA抗原检测试剂盒,其特征在于：所述终止液为1-3mol/L的硫酸溶液。
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