[发明专利]用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒及检测方法

说明书

本发明提出了一种用于中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)检测的试剂盒及检测方法，通过体外刺激诱导产生NETs，对其进行定性和定量检测。适用于检测生理或病理条件下受试者NETs的生成能力，对促进或抑制NETs生成药物的筛选，以及其他与NETs相关的免疫实验研究等。本发明的试剂盒不仅限于人类样本的检测，还可用于其他物种NETs的检测，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、猪等，具有广泛的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒领域，可以用于诱导中性粒细胞胞外诱捕网生成，并对其进行定量检测，属于生物医学研究领域。

背景技术

正常机体受到外界病原微生物等的刺激后，通过一系列固有免疫和适应性免疫反应抵抗感染、行使免疫防御功能。其中，固有免疫是机体先天获得的第一道防线，出现早且反应迅速，在机体清除病原体的过程中发挥重要作用。中性粒细胞是固有免疫系统的重要组成部分。2004年人们首次发现了一种中性粒细胞新型抗感染机制，即中性粒细胞经病原体活化刺激后释放中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)参与病原体感染的免疫应答。NETs是由中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种网状结构，以DNA为骨架，其间镶嵌有组蛋白、髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G、钙网蛋白、蛋白酶3等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白。NETs主要依靠其独特的三维网状结构捕获病原体，并依靠包含的大量抗菌蛋白对病原体进行杀灭，同时NETs对病原体的捕捉固定可以增强其他白细胞的吞噬作用。NETs释放发挥其抗菌作用后，可被血浆DNA酶和巨噬细胞快速清除。在各种生理或病理条件下，若NETs不能正常生成，或生成太多，或生成后不能及时被降解，则会导致疾病的发生。研究表明，NETs参与了多种疾病的病理生理过程。例如NETs已被报道与血栓生成、牙周炎发生、自身免疫性疾病的发生等密切相关。

然而目前，国内并没有用于诱导中性粒细胞胞外诱捕网生成，并对其进行定量检测的成品试剂盒，导致各医院、高校、科研院所、第三方检验机构进行本试验检测时困难重重，需要进行大量前期实验条件摸索；且由于参考文献不同等原因，可能导致不同机构进行检测时所用实验方法不同，因此检测结果差异性很大。因此，有必要提供一种中性粒细胞胞外诱捕网检测试剂盒以克服上述缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒及检测方法，能够对中性粒细胞受到刺激后生成的NETs进行定性和定量分析，以克服现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明提出了一种用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒，包括：脱氧核糖核酸酶I溶液、PMA溶液、抗DNA/组蛋白H1抗体、免疫荧光二抗、DAPI和非细胞通透性的DNA特异性染料。

优选的，在所述的用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒中，所述脱氧核糖核酸酶I溶液的浓度为0.01-1mg/ml；所述PMA溶液的终浓度为10-200nM；所述抗DNA/组蛋白H1抗体的终浓度为1-20ug/ml；所述DNA特异性染料为Sytox green或Sytox red，所述DNA特异性染料的终浓度为0.1-1uM；所述DAPI的终浓度为0.1-10ug/ml。

在本发明中，还提出了一种中性粒细胞胞外诱捕网检测方法，采用如上文所述的用于中性粒细胞胞外诱捕网检测的试剂盒，包括如下步骤：

步骤一：使用脱氧核糖核酸酶I溶液对待测细胞进行预处理，消除非NETs来源的DNA；

步骤二：使用PMA溶液对待测中性粒细胞进行刺激，刺激中性粒细胞活化，诱导NETs生成；

步骤三：使用抗DNA/组蛋白H1抗体及免疫荧光二抗对活化后的中性粒细胞进行染色，并使用DAPI进行细胞核染色定位，通过免疫荧光法检测细胞表面DNA/组蛋白H1的含量，对NETs的生成进行定性分析；