[发明专利]细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法及其引物和探针

权利要求书

1.一种细鳞壮鳕的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针由下表中的序列组成：

其中，AP-F表示上游引物；AP-R表示下游引物；AP-P表示探针。

2.一种细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，至少包括如下步骤：

S1：设计细鳞壮鳕的引物和探针，所述引物和探针至少由下表中的一种组成：

其中，AP-F表示上游引物；AP-R表示下游引物；AP-P表示探针；

S2：提取细鳞壮鳕样品中的DNA；

S3：根据所述引物和探针及DNA，进行实时荧光PCR扩增反应，获得检测结果；

S4：将检测结果与预设的Ct值比较，判定样品特性。

3.根据权利要求2所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述上游引物的浓度为10pmol/μL，下游引物的浓度为10pmol/μL，探针的浓度为10pmol/μL。

4.根据权利要求3所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S2具体为：

S21：获取0.2g细鳞壮鳕样品，并在液氮中研磨；

S22：使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提；

S23：将抽提后的DNA溶解在100μL水中，获得DNA液。

5.根据权利要求4所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S3具体为：

S31：获取10μL的Premix Ex Taq，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL的探针以及1μL的DNA液，并加水补足至20μL；

S32：使用实时荧光PCR仪进行实时荧光PCR扩增反应，其中实时荧光PCR扩增反应的程序如下：

95℃预变性10sec；95℃变性5sec；60℃退火并延伸23sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。

6.根据权利要求5所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，在步骤S3后，还包括步骤S30：设置阳性对照、阴性对照及提取空白对照。

7.根据权利要求6所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，在步骤S4之前，还包括步骤S40：获取真核生物的引物和探针，并作为内参照引物和探针；其中真核生物的引物和探针由下表中的序列组成：

其中18SrRNA-F表示上游引物，18SrRNA-R表示下游引物，18SrRNA-P表示探针。

8.根据权利要求7所述细鳞壮鳕的荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤S4具体为：

S41：若检测结果显示空白对照、阴性对照无FAM荧光信号，阳性对照Ct值小于等于30，则判定实时荧光PCR扩增反应有效，否则反应无效；

S42：在实时荧光PCR扩增反应有效的前提下，用内参照引物探针筛选出Ct值≤30的样品；

S43：在Ct值≤30的样品中的特异性曲线出现扩增曲线时，则表示DNA抽提有效，否则应重新提取DNA，直至Ct值≤30；

S44：在实时荧光PCR扩增反应有效，且抽提的DNA有效的情况下，细鳞壮鳕的特异性引物探针检测得到的Ct值≤35时，则判断样品为阳性，若Ct值＞35，则判断样品为阴性。