[发明专利]一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法

说明书

本发明涉及一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。本发明的制备方法包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型。本发明首次在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠中性粒细胞发育的关键基因Gfi1进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下中性粒细胞缺失的新的人源化小鼠动物模型。该小鼠模型具有接受异种移植的潜力，为开发全新的人源化小鼠提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

人源化小鼠模型即是指带有人类功能性基因、细胞或组织的小鼠模型，为了更好的在人源化小鼠体内重建人类的免疫系统，需要先去除小鼠自身的免疫系统，前人已经研究获得了很多经典人源化小鼠模型，如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞完全缺失的NOG、NSG小鼠等。

人类的免疫系统是一个非常重要和复杂的网络系统，其与人类几乎所有疾病的发生都有千丝万缕的关系，为了深入研究人类免疫系统与疾病的关系，这就需要使用各种动物模型来对一些特殊的疾病进行模拟，由于伦理的原因，不能直接使用人作为疾病模型，而小鼠因为易于获取和饲养，且其免疫系统与人类有诸多相似之处，所以在阐明发病机制、药物筛选等方面有巨大的优势。

NOD小鼠是日本学者对远交系Jcl：JCR鼠进行近交培育第6代时从白内障易感亚系中分离出非肥胖糖尿病品系(NOD)和非肥胖正常品系(nod)，是I型糖尿病研究和人源化模型建立中使用最为广泛的小鼠品系，目前一些经典的人源化小鼠模型如NOG和NSG等均是在NOD小鼠遗传背景中制作获得的；中性粒细胞是免疫细胞中重要的一员，其对小鼠的生存至关重要，目前世界范围内还没有关于中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型制作成功的报道；所以，在NOD遗传背景小鼠中制作获得中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型，将为开启此类小鼠在异种移植中的研究提供更好的小鼠模型，也为人源化小鼠的研究开启全新的视野。

发明内容

本发明的目的是提供一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，该方法可操作性强，构建成功率高。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得。

本发明首次在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠中性粒细胞发育的关键基因Gfi1进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下中性粒细胞缺失的新的人源化小鼠动物模型，该模型小鼠中成熟的中性粒细胞完全消失。NOD遗传背景小鼠中利用CRISPR/Cas9系统敲除Gfi1基因在国内外尚属首次，这也是首例缺失中性粒细胞的人源化小鼠模型，具有很高的原创性和非常重要的基础研究和实际应用价值，也为开发全新的人源化小鼠提供了新的思路。

在敲除所述Gfi1基因时，选择3个靶序列，分别如下所示：

Gfi1-sgRNA1：5‘-AGCTTTGACTGTAAGATCTG TGG-3’；

Gfi1-sgRNA2：5‘-GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG-3’；

Gfi1-sgRNA3：5‘-TGCTCATTCACTCGGACACC CGG-3’。

本发明中首次确定了3个针对NOD小鼠Gfi1基因的特异性打靶位点，利用3个sgRNA针对NOD小鼠Gfi1基因进行打靶，保证被打靶基因能够彻底丧失生物学功能，并通过实验证明这三个sgRNA具有很高的剪切效率。