[发明专利]一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法

权利要求书

1.一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，其特征在于：包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得；

在敲除所述Gfi1基因时，选择3个靶序列，分别如下所示：

Gfi1-sgRNA1：5‘-AGCTTTGACTGTAAGATCTG TGG-3’；

Gfi1-sgRNA2：5‘-GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG-3’；

Gfi1-sgRNA3：5‘-TGCTCATTCACTCGGACACC CGG-3’；

在敲除Gfi1基因时，合成4条引物，通过PCR扩增得到3个双链DNA；将所述3个双链DNA转录成3个sgRNA mRNA，将所述3个sgRNA mRNA与Cas9 mRNA共同注射入小鼠受精卵细胞中，得到Gfi1基因敲除受精卵细胞；将所述Gfi1基因敲除受精卵细胞移植进入假孕雌鼠，出生后获得F0代小鼠；

所述4条引物分别如下所示：

Gfi1-IVT-1：TTAATACGAC TCACTATAGG GAGCTTTGAC TGTAAGATCT GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

Gfi1-IVT-2：TTAATACGAC TCACTATAGG GGTACTGACA GGGATAGGGC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

Gfi1-IVT-3：TTAATACGAC TCACTATAGG GTGCTCATTC ACTCGGACAC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

IVT-R：AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC；

将所述IVT-R分别与Gfi1-IVT-1、Gfi1-IVT-2或Gfi1-IVT-3组合后用于PCR扩增，获得3个双链DNA；

获得Gfi1基因敲除F0小鼠以后，鉴定选择Gfi1基因敲除的NOD小鼠与NOD小鼠交配得到F1代杂合子小鼠，再将F1代杂合子小鼠进行自交，筛选出Gfi1基因敲除的纯合子个体即为NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型；同时保留筛选得到的杂合子小鼠，作为后续繁殖的亲本。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA为由pT7-3×Flag-hCas9载体经Agel酶线性化后，在体外转录获得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增时，采用的模板为pX330质粒。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Gfi1基因敲除小鼠基因型的鉴定使用如下引物：

Gfi1-F PCR-F：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’；

Gfi1-F PCR-R：5‘-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述Gfi1-F PCR-F引物的5‘端使用荧光进行标记。

6.如权利要求1所述的制备方法得到的NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型在研究异种移植中的应用。