[发明专利]一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法

说明书

一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于饱和湿度培养箱中培养，在培养液中加入吉西他滨进行诱导，待细胞恢复正常生长时，浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用1.0μmol/L吉西他滨冲击培养，立即更换吉西他滨浓度为0.5μmol/L的培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在10.0μmol/L的吉西他滨中生长，获得能够在含有10μmol/L吉西他滨的培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。本发明的方法简便易行、建立时间短；且耐药指数均达10以上。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞系，具体来说是一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法。

背景技术

胆囊癌是胆管系统最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，致死率一直居高不下，主要原因是胆囊癌患者在早期无特异性症状，因此大部分患者就诊时已属晚期，此外，虽然手术切除是目前的主要治疗手段，但80％的患者在确诊时就已发生转移，手术切除率不到30％，术后复发率很高，预后极差，因此药物化疗对于晚期胆囊癌患者尤为重要。

吉西他滨(Gemcitabine，GEM)是一种核苷类抗代谢药物，可以竞争性抑制DNA的合成，导致肿瘤细胞的死亡，广泛用于多种肿瘤的治疗。以吉西他滨为基础联合铂类化疗药已成为晚期胆囊癌的首选治疗方案，但无法避免的是胆囊癌患者会对吉西他滨产生耐药性。

目前关于胆囊癌吉西他滨耐药机制的研究主要集中在耐药相关蛋白以及耐药基因的表达，尚缺乏系统性的研究，尤其是其关键基因及中心环节的信号通路的研究，此外，关于逆转胆囊癌耐药的研究也很少，其主要原因是胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的缺乏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，所述的这种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法要解决现有技术中没有合适的细胞系用于研究胆囊癌吉西他滨耐药机制的技术问题。

本发明提供了一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，包括如下步骤：

取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含有CO₂体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L的吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，再更换含有吉西他滨浓度为4.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有10.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。