[发明专利]一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因及其应用

说明书

本发明公开了一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，将丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因应用在提高植物耐铝能力中；实验证明丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75具有提高烟草植物耐铝性的功能；GmMATE75基因在酸性土壤植物抗铝毒胁迫中具有的应用价值，可用于植物耐铝分子机理研究和作物抗铝毒分子育种领域。

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程相关技术领域，涉及一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75及其在提高植物耐铝性中的应用。

背景技术

铝胁迫是酸性土壤上影响作物生长的最主要的因素之一。铝作为地壳中含量最为丰富的矿质元素之一广泛分布于土壤之中。一般情况下，铝对作物的生长不会有较大的影响，但是随着pH的降低，铝会以有毒害的离子形态存在于土壤当中。当酸性土壤中Al³⁺的浓度达到微摩尔浓度时，便会通过抑制作物根部生长的方式影响作物对水分和矿质养分的吸收，从而抑制作物的生长，导致酸性土壤上作物的大面积减产。

传统施用石灰中和酸性土壤的方法在一定程度上可以缓解土壤的酸性，从而降低铝毒毒害。但这种方法成本较高，无法大范围实施，并且只能中和表面土壤的酸性起到暂时的成效，而不能从根本上解决铝毒问题。因此，从分子水平分析酸性土壤上铝毒毒害的机理，运用基因工程相关技术培育抗铝毒农作物具有重要的理论价值和实践意义。

大部分耐铝的单子叶和双子叶植物都可以通过根系释放有机酸应对铝胁迫；植物根部分泌的有机酸能与质外体中的 Al³⁺结合为螯合态，并将其排出，从而降低或排除 Al的毒性；同一物种的耐铝毒品系通常比铝毒敏感品系分泌更多的有机酸。

柠檬酸转运蛋白即MATE 蛋白在原核生物和真核生物中都属于一个大的基因家族，通过离子电化学梯度运输次生代谢产物和毒素。高粱的 SbMATE基因对应于抗铝毒的主要 QTL 位点 Alt_SB，是经图位克隆获得的第一个 MATE 家族的抗铝毒基因，在拟南芥中过量表达时能引起 Al³⁺激活的柠檬酸外排，同时伴随抗铝毒能力的增加。此外，HvAACT1也编码 MATE 类蛋白，在抗铝毒基因型大麦的根尖部位组成型表达，Al³⁺能激活 HvAACT1 外排柠檬酸，另外有10 个不同的大麦品系抗铝毒的能力与其根系柠檬酸的分泌量正相关，说明HvAACT1 作为 Al³⁺激活的柠檬酸转运蛋白在大麦抗铝毒方面起着重要作用。小麦中一个MATE 基因的序列表达标签的表达与这个分离群体柠檬酸分泌的表现型相关，说明小麦中也存在类似的通过分泌柠檬酸对抗铝毒胁迫的机制。

发明内容

本发明的目的是提供一种丹波黑大豆柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，基因全长为1288bp，编码如 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明从耐铝性丹波黑大豆中获取柠檬酸转运蛋白基因GmMATE75，通过PCR特异扩增出了该基因的完整片段；回收纯化GmMATE75基因片段，将其连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经酶切检测后获得重组载体pMD18-T-GmMATE75；通过酶切pMD18-T-GmMATE75载体并与载体pENTR-2B进行连接，转化大肠杆菌DH5α，并提取质粒获得入门克隆载体pENTR-2B-GmMATE75；通过Gateway技术的LR反应把GmMATE75基因亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得植物表达载体pK2-35S-GmMATE75，该载体含有增强型启动子，可在受体植物中过量表达目的基因。