[发明专利]一种检测血液中地西泮含量的液相色谱分析方法

权利要求书

1.一种检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(一)标准溶液的标定

首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别和10μL内标工作液及80μL的甲醇混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的地西泮和内标色谱图，在上述地西泮和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为地西泮溶液，所述内标工作液为氯硝西泮溶液；

(a)标准工作液的配制：

精确称取地西泮标准品5mg置于5ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于5ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为0％-25％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有0.5ug/mL-50ug/mL地西泮的范围内配置出各标准工作液，并在-20℃条件下保存；

(b)内标工作液的配制：

精确称取氯硝西泮标准品5mg置于5mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于5mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为0％-25％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为10ug/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；

(二)检测血液的离心

取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

(三)待测样品处理

(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合20s-1min；

(d)用移液枪移取800uL的乙酸乙酯加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合4-6min，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液；

(e)取步骤(d)上清液750uL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N₂缓慢吹干；

(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL的甲醇，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀30s-1min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液即为待测样品；

(四)待测样品的检测

使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的地西泮和内标色谱图，在上述地西泮和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的地西泮药物浓度。

2.如权利要求1所述的检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有地西泮的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有氯硝西泮的浓度。

3.如权利要求2所述的检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液。

4.如权利要求3所述的检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述七种不同浓度的标准工作液分别为含有0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、50.00ug/mL浓度的地西泮溶液。

5.如权利要求4所述的检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(a)和(b)中，标准储备液A和标准内标储备液B均以甲醇溶解配制，配制标准工作液和内标工作液的稀释液为甲醇。

6.如权利要求5所述的检测血液中地西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为230nm，在线过滤器为Agilent 1290Infinity inline filter。