[发明专利]基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法

权利要求书

1.一种基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

步骤1：挑选发育阶段均一、健康的热带爪蟾胚胎；

步骤2：将环境污染物按照等比梯度配制成不同浓度的系列暴露液；

步骤3：将健康的热带爪蟾胚胎置于步骤2的系列暴露液中，在25℃恒温培养箱中连续培养48-72小时；

步骤4：连续采集15分钟内的蝌蚪运动视频，将蝌蚪运动轨迹可视化，测定包括运动距离、平均速度运动、最大运动速度的运动行为参数；

步骤5：采用方差分析对各暴露组与对照组的运动行为参数进行比较，根据检验结果的显著性水平判断是否具有发育毒性，根据相对运动距离与相对运动速度判断发育毒性程度。

2.根据权利要求1所述的基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：采用人工注射人绒毛膜促性腺激素的方法诱导热带爪蟾抱对产卵，在显微镜下挑选来自同一亲本、处于原肠胚早中期、发育正常的热带爪蟾胚胎，置于林格氏液中备用。

3.根据权利要求1所述的基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，所述步骤2中，环境污染物是杀虫剂、除菌剂；将待测污染物溶于水中，再按比例用林格氏液依次等比稀释成所需的浓度梯度系列暴露液；难溶于水的待测污染物先使用助溶剂等比梯度稀释，再取污染物溶液混入林格氏液中，配制成所需浓度的系列暴露液，系列暴露液中助溶剂的终浓度为0.1%；系列暴露液现配现用，其中最高浓度为半致死浓度的50%，稀释比例为1/5-1/2。

4.根据权利要求1所述的基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：将挑选的热带爪蟾胚胎随机分成多个暴露组，分别标记为暴露组1—暴露组n及对照组；对照组使用林格氏液，难溶于水的污染物的对照组使用含0.1%助溶剂的林格氏液；将胚胎置于恒温培养箱中，25℃、黑暗条件下连续培养，24小时更换暴露液，挑除死亡的胚胎。

5.根据权利要求1所述的基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：暴露结束后，将存活的蝌蚪转移至48孔板中，每孔放置一条蝌蚪，加入对应的污染物暴露液或林格氏液500μL；待蝌蚪在48孔板中适应2分钟后，利用CCD相机连续采集记录光照条件下、15分钟内的蝌蚪运动视频，相机帧速率应大于30帧/s，图像大小大于640像素*480像素；应用行为分析系统将每条蝌蚪的运动轨迹可视化，获取运动距离、平均速度运动、最大运动速度的行为参数的定量结果。

6.根据权利要求1所述的基于热带爪蟾蝌蚪运动行为检测环境污染物发育毒性的方法，其特征在于，所述步骤5具体包括：将各暴露组与对照组的运动参数进行方差分析，根据组间比较的显著性水平判断污染物是否具有发育毒性，并根据运动距离、运动速度的变化倍数来判断环境污染物引起的发育毒性程度。