[发明专利]金-长余辉纳米粒子免原位激发检测成纤维细胞激活蛋白

说明书

金‑长余辉纳米粒子(Au‑PLNP)免原位激发检测成纤维细胞激活蛋白(FAPα)的方法，步骤如下：1)制备巯基丙酸修饰PLNP。2)在1)材料表面生长金纳米粒子。3)设计含有红外荧光染料‑脯氨酸‑其它氨基酸肽键(Pro‑X)‑巯基的多肽。4)将3)中多肽和Au‑PLNP连接发光能量共振转移(LRET)探针。5)FAPα可特异性剪断Pro‑X，使Au‑PLNP发射光恢复。在免原位激发条件下，该探针可定量检测FAPα。6)将LRET探针用于免原位激发光学成像。本发明优点：该Au‑PLNP制备方法操作简单，产物水分散性、生物相容性好，是良好的LRET供体。免原位激发检测FAPα方法灵敏度高、检出限低、抗干扰能力强。该Au‑PLNP策略在免原位激发生物传感、成像、治疗以及拉曼增强检测等方面具有广泛的应用前景。

【技术领域】：本发明涉及长余辉纳米粒子表面功能化方法及其应用，特别是金修饰长余辉纳米粒子用于免原位激发检测成纤维细胞激活蛋白。

【背景技术】：长余辉材料俗称夜光材料，它能够储存能量(紫外光、可见光、太阳光、X射线、γ射线等)，即当激发源停止后仍能够较长时间持续发光的材料。与常见的光学成像材料相比，长余辉材料在生物成像中具有很大的优势：超长的发光寿命、突出的免原位激发等优点，可以避免背景荧光的干扰和对生物组织的光毒性。因此，长余辉材料已广泛地应用于生物医学等各个领域。

长余辉纳米材料表面修饰是将其应用于生物医学等领域的关键步骤。长余辉纳米材料经高温煅烧后，其表面几乎没有任何官能团。而现有的长余辉表面功能化方法基本都是通过包硅来实现，但这些方法难免会增加长余辉纳米粒子的粒径，并且步骤多，比较复杂。因此，需要开发其它简单快速的长余辉纳米粒子表面功能化方法。

成纤维细胞激活蛋白最初被称为F19抗原，是由Retting等1988年报道应用单克隆抗体F19识别的一种膜抗原。成纤维细胞激活蛋白属于膜表面丝氨酸蛋白酶类，具有胶原酶和二肽基肽酶活性。后来又进一步证实它表达于多数上皮性肿瘤间质中的成纤维细胞，而在正常成人静息的成纤维细胞及正常组织中通常不表达，提示它是一个增生性成纤维细胞的表面标志物。成纤维细胞激活蛋白这种特异性的表达为各种癌的诊断和治疗提供了一个有前景的靶目标，以它为肿瘤间质标志物的病理诊断、预后判定和肿瘤基因治疗或免疫治疗也是可能的。但目前仍缺少高灵敏度、低检出限和抗干扰能力强的定量检测成纤维细胞激活蛋白的方法。

【发明内容】：本发明针对上述存在的问题，提供了一种金修饰长余辉纳米粒子用于免原位激发检测成纤维细胞激活蛋白的方法。本方法可以简单快速地制备金修饰的长余辉纳米粒子，其水分散性和生物相容性好。将特定氨基酸序列的多肽和金修饰的长余辉纳米粒子连接得到LRET探针，在免原位激发条件下检测成纤维细胞激活蛋白，特异性好，灵敏度高，检出限低，抗干扰能力强。

一种金修饰长余辉纳米粒子用于免原位激发检测成纤维细胞激活蛋白的方法，其特征在于简单快速地制备金修饰长余辉纳米粒子，得到的金修饰长余辉纳米粒子水分散性、生物相容性好。将特定氨基酸序列的多肽和金修饰的长余辉纳米粒子连接得到LRET探针，在免原位激发下定量检测成纤维细胞激活蛋白，特异性好，灵敏度高，检出限低，抗干扰能力强。步骤如下：

1)将长余辉纳米粒子分散至水中，向其中加入巯基丙酸，室温搅拌12-36小时，之后离心弃去上清液，所得沉淀用水洗3次，真空干燥。

2)将巯基丙酸修饰后的长余辉纳米粒子分散至水中，向分散液中依次加入氯金酸溶液和氨水，最后加入还原剂抗坏血酸溶液，室温搅拌。离心弃去上清液，用乙醇、水洗三次，真空干燥，即可得到金修饰的长余辉纳米粒子。

3)设计特定氨基酸序列的多肽。多肽序列中间含有由脯氨酸和其他氨基酸或小分子形成的肽键(Pro-Xxx)，将近红外荧光染料小分子固定在肽键(Pro-Xxx)的一侧，肽键(Pro-Xxx)的另一侧有含巯基的氨基酸，这样的多肽序列可以被成纤维细胞激活蛋白特异性识别并剪断。