[发明专利]目的基因多拷贝整合的方法、重组菌、白藜芦醇以及重组人血清白蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种介导目的基因在酵母中多拷贝整合的方法，其特征在于，包括：

(A)构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株，所述构建表达Cas9核酸酶的酵母菌株为将携带Cas9表达盒的表达载体导入所述酵母菌株，或将Cas9表达盒整合至所述酵母菌株的染色体上；

(B)向所述酵母菌株导入转录gRNA的载体，所述gRNA中的向导序列与所述酵母菌株的rDNA单元序列的片段互补；

(C)向所述酵母菌株导入携带目的基因的修复模板；

(D)去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体，所述去除所述酵母菌株中步骤(A)和步骤(B)导入的载体为通过将所述酵母菌株在无筛选压力的培养基中培养进行载体的消除，或通过同源重组将整合至染色体上的所述表达盒替换为染色体上整合位点的原始DNA片段；

(E)筛选酵母菌株，所述筛选为筛选表达Cas9核酸酶的酵母菌株，筛选转录gRNA的酵母菌株，筛选目的基因整合成功的酵母菌株，和/或筛选至少整合目的基因两个拷贝的酵母菌株；

所述酵母为汉逊酵母Hansenula polymorpha、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae、毕赤酵母Pichia pastoris、念珠菌属酵母Candida species、裂殖酵母Schizosaccharomyces Pombe或克鲁维亚酵母Kluyveromyces；

所述目的基因为编码酪氨酸氨解酶的基因TAL、编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL和编码芪合酶基因STS，所述TAL如序列表SEQ ID NO.17所示，所述4CL如序列表SEQ ID NO.18所示，所述STS如序列表SEQ ID NO.19所示。

2.根据权利要求1所述方法构建的重组菌，所述重组菌的rDNA单元包含所述目的基因的至少两个拷贝，且不包含外源遗传标记基因；

所述目的基因为编码酪氨酸氨解酶的基因TAL、编码4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL和编码芪合酶基因STS，所述TAL如序列表SEQ ID NO.17所示，所述4CL如序列表SEQ ID NO.18所示，所述STS如序列表SEQ ID NO.19所示。

3.一种白藜芦醇的制备方法，其特征在于，包括发酵权利要求2所述的重组菌。