[发明专利]产肝素酶的施氏假单胞菌菌株及从其衍生的肝素酶

说明书

提供一个产肝素酶的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株及从其衍生的肝素酶。还提供该肝素酶的制备和应用。

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体而言，本发明涉及一个产肝素酶的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株及从其衍生的肝素酶。此外，本发明还涉及所述肝素酶的制备和应用。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，其应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、制备低分子肝素、用于肝素结构的研究和质量检测等。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又陆续在一些微生物和动物组织中也发现了肝素酶的存在。目前有论文报道的肝素酶有20多种，例如Yang V.C.从肝素黄杆菌中发现肝素酶I、II、III，Robert W.Bellamy等人从杆菌属BH100(FERM BP-2613)细菌中发现的分泌于胞外的肝素酶，Wan-Seok Kim等人从粪便拟杆菌HJ-15中发现一种肝素裂解酶(Carbohydrate Research,2012,359:37-43)。中国专利申请201410839278.8披露了从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到的新型肝素酶SDhepI和SDhepII。中国专利申请201510040524.8披露了从脑膜脓毒性金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)细菌中得到新型肝素酶CMhepI。上述酶均为不同的肝素酶。

目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。

从自然界中得到的不同的产肝素酶微生物的所产肝素酶也多种多样，其用于酶解肝素得到的产物也各不相同。为了满足研究和工业上的多样化需求，本领域仍需要新的肝素酶。

发明内容

在第一方面，本发明提供一种施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株，所述菌株以保藏号CCTCC M 2017174保藏于中国典型培养物保藏中心。

该菌株是本发明人从野外分离得到一株具有裂解肝素或其衍生物的活性的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌株，命名为Z7。本发明人进一步从该菌株分离、纯化出两种新型胞内肝素酶PShepI、PShepII。这两种新的肝素酶理化性质不同于目前已知肝素酶，且酶解肝素时酶切位点选择性强，可用于肝素产品质量检测，或者制备低分子或超低分子肝素。

因此，在另一方面，本发明还涵盖了所述施氏假单胞菌Z7菌株在生产肝素酶中的应用和方法。例如，从所述Z7菌株生产肝素酶的方法可以包括培养所述施氏假单胞菌Z7菌株，裂解培养获得的施氏假单胞菌细胞，从裂解产物分离和/或纯化肝素酶。优选地，所述培养在合适的条件下进行。例如，施氏假单胞菌Z7菌株可以在大约30℃的温度下培养。在一些实施方案中，所述培养是发酵。本领域技术人员容易确定施氏假单胞菌的合适培养/发酵条件。所述裂解可以通过本领域已知的多种破碎细胞的方法进行，例如冻融裂解、超声处理、高压处理等。此外，本领域技术人员可以根据具体肝素酶的性质如分子量、等电点等选择合适的方法从细胞裂解物分离和/或纯化肝素酶，例如可以通过分子筛、阴离子交换层析、阳离子交换层析、肝素酶亲和层析等分离和/或纯化特定肝素酶。

在另一方面，本发明提供了衍生自施氏假单胞菌，优选衍生自本发明的施氏假单胞菌Z7菌株的肝素酶。所述肝素酶例如是PShepI或PShepII。

在一些实施方案中，所述肝素酶(如PShepI)具有选自以下的一或多种特征：

i)74791Da的分子量；

ii)约7.77的等电点；