[发明专利]产生北方叶枯病抗性玉蜀黍

说明书

本文提供了用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列、经修饰的NLB18序列或两者的植物细胞的组合物和方法。所述方法涉及在内源Ht1编码序列、内源NLB18编码序列或两者中将双链断裂引玉蜀黍基因组中，以修饰基因组序列，从而增强从植物细胞产生的植物的北方叶枯病抗性。进一步提供了将Ht1和/或NLB18的抗性等位基因引入基因组中的特定位点的方法。还包括由植物细胞产生的植物和由植物产生的种子。为了在双链断裂诱导中使用CRISPR‑Cas系统，还提供了指导多核苷酸。

技术领域

该领域属于分子生物学，并且更确切地说，是用于编辑植物细胞的基因组以生产北方叶枯病(northern leaf blight)抗性玉米的方法。

以电子方式提交的序列表的引用

该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为7156WO_SEQLIST.txt，创建于2016年10月13日，并且具有240千字节大小，并且与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。

背景技术

由真菌病原体玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)(之前称为大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum))诱导的北方叶枯病(NLB)是在许多热带和温带环境中严重的玉蜀黍叶枯萎病。症状可以从下部叶片上的雪茄形病变到叶子的完全破坏，从而降低可用于光合作用的叶表面积的量。光合能力的降低导致籽粒灌浆所需的碳水化合物缺乏，这会影响籽粒产量。因为露期很长且温度适中，热带的中海拔区域(海平面以上约900-1600m)存在对北方叶枯病尤其有利的气候。然而，在温带环境中(例如在美国)，在湿季期间，特别是如果在抽丝期在植物的上部叶上确定感染，则北方叶枯病还可能产生30％-50％的损失。

控制北方叶枯病的最有效和最优选的方法是种植抗性杂交种。对病原体的特定种族的抗性可以通过某些天然抗病性玉蜀黍基因来控制，例如Ht1、Ht2、Ht3、Htm1、Htn1、HtN、HtP、ht4和rt(Welz和Geiger 2000.Plant Breeding.[植物育种]119(1)：1-14；Ogliari等人2005.Genet Mol Biol[遗传学与分子生物学]28：435-439；Hurni等人2015 PNAS[美国科学院院报]112(28)：8780-5)。然而，将抗性基因渐渗入其他近交系是一项艰巨的任务，由于连锁累赘，可能会或可能不会产生产量损失。需要更有效地且以某种方式生产北方叶枯病抗性玉蜀黍植物，该种方式将经由常规手段减少与多个抗性基因座渐渗入优良玉蜀黍品系相关的连锁累赘。

发明内容

通过以下方式可以克服对将北方叶枯病抗性渐渗入玉蜀黍品系的常规育种的限制：编辑赋予对北方叶枯病增强的抗性的基因(例如像Ht1和NLB18)；或者将Ht1和NLB18的抗性等位基因移动到基因组中的另一个位点，使得可以通过将包含多个核苷酸序列的单个基因组基因座渐渗入玉蜀黍植物中来获得对北方叶枯病的增强的抗性，所述多个核苷酸序列的每一种都赋予对北方叶枯病的增强的抗性。

本文提供了用于获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞的方法。所述方法包括：在玉蜀黍植物细胞中的内源HT1编码序列中的一个或多个靶位点处引入双链断裂或位点特异性修饰，并且获得具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞。所述方法可以进一步包括在玉蜀黍植物细胞中引入Ht1取代模板，其中所述Ht1取代模板与内源HT1编码序列相比包含至少一个核酸改变，并且其中所述Ht1取代模板并入内源HT1编码序列中。双链断裂可以由核酸酶诱导，例如但不限于TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶或CRISPR相关核酸酶。所述方法可以进一步包括从具有经修饰的Ht1核苷酸序列的玉蜀黍植物细胞生长玉蜀黍植物，并且该玉蜀黍植物可以展现出对北方叶枯病的增强的抗性。