[发明专利]长寿α-溶血素纳米孔

说明书

本文描述了具有至少一个在成熟、野生型α‑溶血素氨基酸序列中的H35G、E111N、M113A和/或K147N处的氨基酸取代的α‑溶血素的变体。在某些实例中，所述变体可以具有在成熟α‑溶血素氨基酸序列中的E111S、M113S、T145S、K147S或L135I处的取代。α‑溶血素变体还可以包括成熟、野生型α溶血素的H144A处的取代和/或跨越残基127至131的一系列甘氨酸残基。还提供了包括α‑溶血素变体的纳米孔组装体，所述组装体具有增加的纳米孔寿命。进一步，提供了变体，所述变体，除了提供增加的寿命以外，还提供了减少的穿入时间。因此，本文提供的变体增加纳米孔寿命并改善使用包含所述变体的纳米孔的DNA测序反应的效率和准确度。

相关申请。

技术领域

公开了涉及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus) α-溶血素变体的方法和组合物，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素变体当组装成多亚基纳米孔时，增加纳米孔在核酸测序反应期间的测序寿命。还公开了当组装成多亚基纳米孔时改善测序效率和准确度的变体。

背景

溶血素是由多种生物体产生的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素(例如α溶血素)可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜(例如，宿主细胞膜)的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物(例如，多肽或多核苷酸)从膜的一侧运输到另一侧。

α-溶血素(α-HL、a-HL或alpha-HL)是在宿主细胞膜中形成通道的自组装溶血素毒素。更具体地，七个α-溶血素单体组装成生物膜中的七聚体β-桶孔。α-溶血素具有许多有利的性质，包括高稳定性和自组装成足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的纳米孔(Kasianowicz等人, 1996)。基于这些性质和其它性质，α-溶血素已成为纳米孔测序群体的主要组分。

以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人, 1996, Akeson等人, 1999, Meller等人, 2001)，考虑到转移速率(在100 mV为~1 nt/ μs)和离子电流信号中的固有噪声，这是一项非常困难的任务。通过并入永久束缚到孔内部的探针分子，已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人, 2001a和Howorka等人, 2001b; Movileanu等人, 2000)。

尽管纳米孔的使用已经彻底改变了DNA测序，但使用野生型α-溶血素的纳米孔只能在短时间量内产生序列数据。因此，α-溶血素纳米孔在测序反应期间的寿命经常充当测序反应的限速特征。进一步，野生型α溶血素的使用经常导致显著数目的缺失错误，即没有测量到碱基。因此，需要具有改善的性能(包括增加的测序寿命)的α-溶血素纳米孔。

发明简述

本文提供了突变型葡萄球菌α溶血素(αHL)多肽，其在并入纳米孔中时改善纳米孔在DNA测序反应期间的寿命。例如，包括一种或多种本文所述的变体的纳米孔比由野生型α溶血素组成的纳米孔持续更长时间 – 且因此提供更多的测序数据。

在某些实例方面，α-溶血素(α-HL)变体在对应于SEQ ID NO:14 (成熟的野生型α溶血素序列)的E111N、M113A、K147N或其组合中的任一个的位置处包含取代。α-溶血素变体还可以包括SEQ ID NO:14的H35G或K135G处的取代。在某些方面，α-溶血素变体还可以包括SEQ ID NO:14的残基126-131处的一个或多个甘氨酸残基，诸如跨越SEQ ID NO:14的残基126至131的整个长度的一系列甘氨酸残基。例如，所述变体还可以包括对应于如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列的氨基酸127-129的多-G取代，产生SEQ ID NO:14的126至131的甘氨酸残基的跨度。