[发明专利]一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法

权利要求书

1.一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)产脲酶细菌的富集

1.1)采集原位沙滩钙质砂样品，将取得的土样去除杂质、筛分处理，控制粒径小于0.85mm；按每份10g～20g分装于干净的试管中，贮藏于4℃环境；

1.2)取步骤1.1)中贮藏时间不超过15天的新鲜钙质砂加入装有富集培养液的试管中，置于恒温振荡培养箱中进行培养；

所述恒温振荡培养箱的温度范围为25～35℃；

所述培养时间范围为14天；

所述钙质砂与富集培养液的重量体积比(g︰mL)范围为1︰100～1︰200；

1.3)将步骤1.2)中得到的培养液，加入到浓度为1.1mol/L的尿素溶液中，得到混合物A；使用电导率测试仪测定混合物A的电导率；

所述培养液与尿素溶液的体积比为1︰9；

当混合物A的电导率平均5分钟变化大于0.1ms/cm时，则表示产脲酶细菌的存在；

所述有产脲酶细菌存在的混合物A为产物A；

2)分离纯化产脲酶细菌

2.1)取步骤1.3)中得到的产物A体积15～20ml涂布到分离培养基平板上，置于培养箱中进行培养；

所述培养箱的温度范围为30℃；

所述培养时间范围为15天；

2.2)观察步骤2.1)中得到的产物B的菌落生长情况，挑取圆形黄色的单菌落划线到BUG+B鉴定培养基上进行培养；

3)产脲酶细菌的鉴定

3.1)使用接种环挑取步骤2.2)中的单菌落到鉴定培养液GN/GP-IF管壁上，并用接种环将细菌打散，使细菌与鉴定液混合，至比浊计上混浊度在90～95％之间；

3.2)使用接种液用排枪将步骤3.1)中得到的产物C接种到鉴定培养板上，根据每个细菌的生长速度，在30℃的恒温振荡培养箱中培养1～7天，采用Biology Microstion微生物鉴定系统进行快速鉴定；

4)产脲酶细菌的脲酶酶活力检测：

将步骤3.2)中分离纯化所得巴氏芽孢杆菌产脲酶菌株分割成2mm×2mm×1mm块状胶体，检测脲酶酶活力。

2.根据权利要求1所述的一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于：所述步骤1.2)中的富集培养液的成分包括酵母菌提取物、氯化铵、一水硫酸锰和六水氯化镍；其中：酵母菌提取物的浓度为20g/L，氯化铵的浓度为10g/L，一水硫酸锰的浓度为10mg/L，六水氯化镍的浓度为10mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于：所述步骤1.2)中富集培养液的最适pH值为7.0～10.0。

4.根据权利要求1所述的一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于：所述步骤2.1)中的分离培养基的成分包括酵母菌提取物、氯化铵、一水硫酸锰、六水氯化镍和琼脂；其中：酵母菌提取物的浓度为20g/L，氯化铵的浓度为10g/L，一水硫酸锰的浓度为10mg/L，六水氯化镍的浓度为10mg/L，琼脂的浓度为15g/L。

5.根据权利要求1所述的一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于：所述步骤2.2)中的BUG+B鉴定培养基的成分包括BUG琼脂培养基和脱纤羊血；其中：BUG琼脂培养基浓度为57g/L，脱纤羊血的浓度为50ml/L。

6.根据权利要求1所述的一种钙质砂中产脲酶细菌的高效分离与鉴定方法，其特征在于：所述步骤3.1)中的鉴定培养液GN/GP-IF成分包括氯化钠、聚醚F-68和吉冷胶；其中：氯化钠浓度为4g/L，聚醚F-68的浓度为0.3g/L，吉冷胶的浓度为0.2g/L。