[发明专利]一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用，所述体系包括Rab1、SidM/DrrA、荧光素酶C端、荧光素酶N端、连接肽和还原剂TCEP，所述Rab1的C端通过连接肽与荧光素酶N端相连，所述SidM/DrrA通过连接肽与荧光素酶C端片段相连；本发明通过引入特异性相互作用的蛋白对，并设计适宜的柔性肽和结合位置，优化缓冲液中还原剂的种类和浓度，最终显著提高荧光互补效率，最高达到30倍；本发明提供的制备方法简洁高效，便于操作，易于推广，具备广阔的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用。

背景技术

随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断追朔到蛋白质、基因水平。而许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质之间的相互作用(Protein-protein interaction,PPIs)为纽带，形成信号转导网络系统。因此，对蛋白质之间的相互作用的深入研究是认识和理解各种生命现象的必要前提。

迄今为止，已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用。传统研究蛋白质之间的相互作用的方法有酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等，但在实际的生理环境中需要破碎细胞造成机械损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质相互作用进行研究的特点。现今最为常见的蛋白质相互作用模型有2种，其主要基于医学影像技术，是探究体内细微生命的重要方法，可实现分子水平上高靶向地实时监测活体内疾病的发生、生长及治疗，是一种新的健康医疗模式。其中一种是基于CFP和YFP等荧光蛋白质来实现的荧光共振能量转移，这种技术由于荧光蛋白的量子产率低，供体与受体荧光光谱的差异小等问题，在实际开展中导致检测通道间相互干扰，高背景噪音等现象，要求非常苛刻的校准过程去除干扰降噪，这些都极大地限制了该技术进一步的发展和广泛的应用。另外一种是双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescencecomplementation,BiFc)克服了传统荧光共振能量转移的诸多缺点，是近几年兴起的一项新技术，而Gaussia荧光素酶(Gluc)因其超高的荧光强度，无需外源激发光干扰，可作为高灵敏度的光信号载体，近年来被广泛用于该技术的研究，其主要原理是将荧光素酶在某些特定的位点切开，形成不发荧光或荧光强度很低的N端和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时,不能自发地组装成完整的荧光素酶，在该荧光素酶在底物的催化氧化作用下不能产生荧光。但是，当这2个荧光素酶的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光素酶的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光素酶分子，并在该荧光素酶底物的作用下发射荧光。因此，在荧光互补体系中，发挥重要作用的是这样一组可以发生特异性相互作用的蛋白对，即形成有效的帮助结构域(Helper domains)拉近2种荧光素酶片段的空间距离实现荧光互补重建荧光素酶荧光活性。

双荧光互补技术最大的难点在于空间上自组装形成荧光互补的效率太差，导致双荧光互补技术在实际应用中大大受限。在设计荧光素酶片段融合体时需要注意引入的2个蛋白对对荧光素酶片段的影响，特别是如何形成有效的正确的帮助结构域对荧光互补效率的巨大影响，这就需要在设计上进行巧思。因此，提供一种改进双分子荧光互补体系中的荧光互补效率的技术具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用，通过引入一组具有特异性相互作用的蛋白对，并设计适宜长度的柔性连接肽和有效的互补面，优选还原剂的种类和浓度，最终显著提高荧光互补效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：