[发明专利]一种荧光素酶荧光互补体系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种荧光素酶荧光互补体系，其特征在于，所述体系包括Rab1、SidM/DrrA、荧光素酶C端、荧光素酶N端、连接肽和还原剂TCEP；

所述Rab1的C端通过连接肽与荧光素酶N端相连，所述SidM/DrrA的N端或C端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连；

所述连接肽为柔性连接肽；

所述柔性连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)₂。

2.根据权利要求1所述的互补体系，其特征在于，所述SidM/DrrA的N端通过连接肽与荧光素酶C端片段相连。

3.根据权利要求1或2所述的互补体系，其特征在于，所述荧光素酶包括Gaussia荧光素酶、海肾荧光素酶或NanoLuc荧光素酶中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的互补体系，其特征在于，所述荧光素酶为Gaussia荧光素酶；

所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM。

5.根据权利要求4所述的互补体系，其特征在于，所述还原剂TCEP的浓度为3-5mM。

6.一种制备如权利要求1-5中任一项所述互补体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建蛋白对SidM/DrrA和Rab1片段与荧光素酶片段融合基因表达载体；

(2)将步骤(1)得到的载体转染细胞并表达纯化；

(3)建立荧光互补体系并检测分析生物发光活性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体的构建步骤如下：

(1’)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽与荧光素酶N端相连为融合体1；

(2’)将所述SidM/DrrA通过柔性连接肽与荧光素酶C端片段相连为融合体2；

(3’)将融合体1和融合体2通过PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述建立荧光互补体系的具体步骤为：

将表达的融合体1蛋白与融合体2蛋白加入缓冲液中混匀后，再加入还原剂TCEP，4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述荧光互补体系中的蛋白浓度为4-6μM；

所述还原剂TCEP的浓度为2-6mM；

所述检测的荧光素酶的底物添加量为5.5-6.2μM。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述还原剂TCEP的浓度为3-5mM。

12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将所述Rab1的C端通过柔性连接肽(GGGGS)₂与Gaussia荧光素酶N端相连为融合体1；

(2)将所述SidM/DrrA的N端通过柔性连接肽(GGGGS)₂与Gaussia荧光素酶C端片段相连为融合体2，所述融合体1和融合体2的C端带有纯化标签；

(3)将融合体1和融合体2通过PCR扩增、酶切连接、转化至感受态细胞后筛选鉴定；

(4)将步骤(3)得到的载体转染细胞并表达纯化；

(5)将融合体1蛋白与融合体2加入缓冲液中混匀后，体系中蛋白浓度为4-6μM，再加入终浓度为2-6mM的还原剂TCEP，4℃震荡孵育过夜后检测分析生物发光活性。

13.一种如权利要求1-5中任一项所述荧光素酶荧光互补体系用于制备光信号载体、体外诊断检测探针或检测设备中的任意一种或至少两种组合的应用。