[发明专利]一种高灵敏度的铅离子检测方法

权利要求书

1.一种高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品处理：先将待测样品经0.22μm的超微滤膜过滤，再分别稀释10倍、20倍、50倍、100倍、500倍和1000倍，得样品稀释液；

（2）引物制备：将样品稀释液分别加入GR-5脱氧核酶中至体积为40μL，于25℃孵育切割3min，再加入5μL终止液，混合均匀，于4℃进行保存，得引物单链X；

（3）互补杂交：分别吸取3μL引物单链X、3μL摩尔浓度为1μM模板链X’-Y’、3μL摩尔浓度为2.5mM的dNTPs、15.2μL超纯水，混合均匀，先于95℃孵育5min，得杂交链；

（4）等温扩增：向杂交链中加入5.8μL复合酶溶液，于55℃孵育8min，再置于95℃保温10min，置于-20℃备用，得单链Y-G4-DNA；

（5）模拟酶制备：分别吸取10μL单链Y-G4-DNA、30μL酶活缓冲液、60μL血红素Hemin稀释溶液，混合均匀，于37℃保温反应30min，得模拟酶Hemin-G4；

（6）催化显色：向模拟酶Hemin-G4中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色液50μL，混合均匀，于37℃恒温反应10min，再加入50μL摩尔浓度为2M的硫酸溶液，混合均匀，于450nm处检测吸光值，得450nm吸光值；

（7）铅离子浓度计算：将450nm吸光值带入线性回归方程，得铅离子浓度。

2.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的GR-5脱氧核酶的制备方法，包括以下步骤：分别取摩尔浓度为10μM的GR-5-底物链4μL，摩尔浓度为10μM的GR-5-酶链4μL，加入缓冲液和水至40μL，使缓冲液中NaHEPES摩尔浓度为50mM、NaCl摩尔浓度为50mM、MgCl₂摩尔浓度为5mM，pH为7.26，于95℃加热14~16min，然后缓慢降至24~26℃，得GR-5脱氧核酶。

3.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中的终止液，由以下摩尔浓度的原料制成：EDTA 0.2M、NaCl 2M、Tris 0.5M。

4.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中的复合酶溶液，由以下原料制成：8U/μL的Bst DNA聚合酶0.1μL、10×的聚合酶反应缓冲溶液3μL、10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶1.2μL、10×的Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液1.5μL。

5. 根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的酶活缓冲液，由以下摩尔浓度的原料制成：Tris 100mM、NaCl 120mM、MgCl₂ 10mM、KCl 100mM，pH为8.4。

6.根据权利要求1所述高灵敏度的铅离子检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的血红素Hemin稀释溶液，吸取2μL Hemin原液，加入所述的酶活缓冲液1mL，混合均匀，得血红素Hemin稀释溶液。