[发明专利]一种检测山茶属植物细胞核DNA含量的方法

说明书

本发明提供了一种检测山茶属植物细胞核DNA含量的方法，包括如下步骤：切取山茶属植物叶片或茎段，获取外植体；对所述外植体进行消毒预处理；诱导愈伤组织；处理经诱导的愈伤组织，使其发生细胞核分离,过滤；对步骤(4)得到的滤液进行染色以制备待测细胞核裂解溶液；以及通过流式细胞仪检测所述待测细胞核裂解溶液的细胞核DNA含量。本发明的方法在山茶属植物的倍型检查、基因组大小测定等方面具有应用意义，为山茶属植物的多倍体育种提供了新的分析技术。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种利用山茶属植物愈伤组织分析细胞核DNA含量的方法。

背景技术

山茶属物种资源丰富，包含许多具有重要经济价值的木本植物。研究表明植物细胞核的DNA含量(倍性)与形态、抗性等性状具有相关性，使得倍性育种成为获得新品种、新种质的重要途径。

流式细胞技术(Flow Cytometry)是二十世纪末兴起的分析技术，也是分析植物细胞核DNA含量的最重要的手段之一。利用流式细胞手段，精确且高效地检测山茶属植物细胞核DNA的含量，是山茶属植物倍性育种的关键技术。但是，山茶属植物的组织中含有复杂的次生代谢物质，使得常规的细胞核裂解液体系(如Galbraith缓冲液、LB01溶液、Otto’s缓冲液等)极易氧化造成浑浊和粘稠，不能用于流式细胞分析。

在山茶属植物的研究中，Huang等(PLoS ONE 8(5):e64981DOI:10.1371/journal.pone.0064981)于2013年报道了一种通过利用完整植物组织分解细胞核，并检测基因组DNA含量的方法。该报道中，研究者配制了一种细胞核裂解液，WPB溶液(Tris 0.2M,MgCl₂ 4mM,EDTA-Na2 2mM,NaCl 86mM,二硫苏糖醇DTT 20mM,聚乙烯吡咯烷酮PVP-10 1％(质量体积比),Triton X-100 1％(体积比),PH＝7.5)，直接利用嫩叶、芽组织进行处理，进而开展流式细胞分析测定细胞核的DNA含量。通过添加大量抗氧化剂(DTT)和单宁结合物质(PVP-10)，所述WPB缓冲液在一定程度上解决了组织裂解液的沉淀和背景荧光的问题，但是采用该技术的成功率不高，且测定的结果误差较大，具体缺陷如下：(1)该方法对植物材料要求较高，必须使用十分幼嫩的组织进行实验；(2)有些山茶属材料(如油茶、茶梅等)，即使是嫩叶或嫩芽中，也含有大量的次数代谢物质，特别是单宁类物质能与所用的DNA染料结合，造成测量结果的误差变异增大；(3)细胞核裂解液中包含了高浓度的PVP-10(1％，质量体积比)和DTT(20mM)，造成裂解液粘稠，易堵塞流式细胞仪的管路系统。

因此,目前对于如何通过流式细胞仪准确测定山茶属植物的细胞核DNA含量仍然是一个亟需解决的技术难题。

发明内容

为了解决目前利用新鲜组织检测山茶属植物细胞核DNA中的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种通过诱导愈伤组织开展流式细胞分析的技术体系。

本发明提供了一种检测山茶属植物细胞核DNA含量的方法，包括如下步骤：

(1)切取山茶属植物叶片或茎段，获取外植体；

(2)对所述外植体进行消毒预处理；

(3)诱导愈伤组织；

(4)处理经诱导的愈伤组织，使其发生细胞核分离,过滤；

(5)对步骤(4)得到的滤液进行染色以制备待测细胞核裂解溶液；以及(6)通过流式细胞仪检测所述待测细胞核裂解溶液的细胞核DNA含量。

本发明还提供了上述方法在山茶属植物的倍型检查、基因组大小测定以及多倍体育种方面的应用

基于此，本发明的突出优点在于：

与现有的技术相比，